食品致病微生物

食品致病微生物最新檢測方法介紹組員：洪碩蓮、黃建元、楊至平、閻瑩潔報告學生：報告日期：1內容大綱•食品汙染主要菌株p3-5•傳統檢驗方法p6-7•生物晶片p8-11分類基因晶片p12-26組成製造過程、條件作業流程優、缺點應用海內外晶片公司p28參考資料p292前言•民國70年至93年，台灣地區食品中毒事件案例前六名依序為：•腸炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)•金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)•仙人掌桿菌(Bacilluscereus)•沙門氏菌(Salmomellaspp)•病原性大腸桿桿菌(pathogenicE.coli)•肉毒桿菌(Clostridiumbotulinum)3表一、民國70年至93年台灣地區食品中毒案件病因物質分類表病因物質/年別70~798081828384858687888990919293總計腸炎弧菌14412202535461051601027584528682641092沙門氏菌23330589457996118110病原性大腸桿菌400402710001000055金黃色葡萄球菌962318241312714361191879281仙人掌桿菌4413151212117151212584117188肉毒桿菌7000000000000007其他41020410000310019細菌總計29942495462751221771149111678111105881583單位：案件資料來源：衛生署食品資訊網•歐美國家，由沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌所引起之食物中毒案件急速增加。•日本，由沙門氏菌、腸炎弧菌及仙人掌桿菌所引起之食物中毒案件亦受到相當的重視。5傳統檢驗法•預培養(preculture)•選擇性培養基培養(selectivemediumculture)•生化型鑑定(biotypetest)•血清型鑑定(Serotypetest)•DNA探針•PCRfingerprinting•multiplex-PCR•DNA定序•PCR-RFLP•gene-specificprobehybridization•ribotyping6傳統檢驗法-缺點•耗時長•操作大量樣品時方便性不佳•無法同時鑑別不同種屬的菌株•目前PCR技術的缺點，是對於不同的目標基因或目標菌必須要用不同的引子組進行檢測。在目標菌種不明確時，如何選擇適當的引子組即是一個問題，而造成檢測上因難。7生物晶片•在玻璃、矽片、塑膠或其他材質上，利用微電子、微機械等精密技術，製成應用於基因表現、基因序列或生物化學分析。其作用對象可以為基因、蛋白質或細胞組織等。8基因晶片(genechip)生物晶片微流體晶片(microfluidics)(Lab-on-a-chip)蛋白質晶片(proteinchip)檢測型晶片(微陣列晶片)處理型晶片(微處理型晶片)在微面積的基質上，種植高密度的生物探針做為大量篩檢及平行分析的工具。具備快速、方便、經濟、省時等特性，適用於大量基因表達、篩檢、比對等研究，可應用在病原體基因檢測、基因表現比較、基因突變分析、基因序列分析、及新藥物開發等領域。處理生物樣品、進行生物性反應、或分析生物體之工具。樣品前處理晶片可用來處理血液、組織、植物等樣品，減少人為操作時，可能產生的危險和污染；反應型晶片用來從事微量化有機化學反應、生化反應、或酵素反應以共軛互補的核酸為探針(probe)，整齊的排列在晶片上，用以和具有互補序列的核酸片段(target)產生雜交結合，而固定在載體上，之後將沒有雜合的樣本DNA去掉，這時因為target帶有螢光染劑，就可以利用雷射激發螢光，記錄下有雜交反應的點的位置。以蛋白質為生物探針，整齊的排列在晶片上，進行抗原-抗體免疫反應，用以檢測蛋白質。由於生物體內之基因表現並不一定等同於蛋白質表現，絕大多數生物體外表均係為基因經過RNA修飾後所產生之蛋白質構造，因此蛋白質晶片的優勢是檢測時間短，且無須前處理過程。將檢測程序中所需利用的種種元件，如混合反應槽、加熱反應槽、分離管道，與偵測容槽等，都集中在同一晶片上製作，再藉由外加電壓所產生的電滲流，或利用微小化幫浦或離心力等方式，驅動樣品或試劑在各元件間相連的微管道中移動，以完成檢測。9://蛋白質晶片作用示意圖製備方法與基因晶片方法相似，差異處只是將作用對象改為蛋白質。實際的應用上需克服：1.蛋白質取得不易2.蛋白質容易失活3.載體製作不易4.不容易維持晶片上蛋白質的生物活性5.晶片與受測檢體間的最佳反應條件不一定相同。10微流體電泳晶片構造示意圖在晶片基座上蝕刻50∼100微米等深、寬呈十字形的溝槽，四個端點各蝕刻一容器槽，以放置試液或樣品。基因晶片•基因晶片的組成大致可分為：載體、targetDNA、probeDNA。NatureGenetics21,p.6,1999載體targetDNAprobeDNA12載體尼龍膜硝化纖維膜矽晶片玻璃晶片玻璃slide片高分子晶片成本1-10NTD35-70NTD3-8NTD1NTD材質組成有機聚合物無機矽及二氧化矽二氧化矽有機聚合物靈敏度稀釋200倍仍可辨識稀釋500倍仍可辨識稀釋500倍仍可辨識稀釋5000倍仍可辨識13targetDNA訊號產生源優點缺點放射性原子高訊號強度•需特殊操作執照•廢棄物不易處理•容易產生互相干擾螢光染料訊號強度頗佳•易受背景干擾•需使用價格昂貴的訊號處理機非螢光染料(如酵素呈色)訊號強度較弱•可使用一般訊號讀取機14probeDNA•DNA的長度要能兼顧成本以及有效的辨認能力。太長的話製造成本太高，且製造過程中容易出錯，太短則無法分辨出不同的樣本DNA，5~15個mer是比較適合的長度。•序列要具有專一的辨識能力。一個基因的長度是以kbp為單位的，所以要如何設計一個十幾個mer的probeDNA去辨識一個基因不是一件容易的事情。15製造技術•第一種：Affymetrix公司研發出的，光學光刻法(photolithography)與化學合成法相結合的光引導原位合成法(light-directedsynthesis)，類似半導體IC電路製造的方法。~b881601/biochip/16•第二種：Stanford大學所使用的接觸式點樣法，利用預先合成好的DNA以機器手臂快速、高密度的固定到載體上。MicroarrayBiochipTechnology,Eaton17•第三種：類似噴墨方式的非接觸式點樣法，將DNA噴到載體上。MicroarrayBiochipTechnology,Eaton18製備條件•probeDNA固定要牢固•每個點的probeDNA濃度要一樣•probeDNA的點要小，以符合高密度陣列的要求19作業流程MicroarrayBiochipTechnology,EatontargetDNA序列分析probeDNA序列製備序列雜合配對雷射激光讀取訊號結果數據分析20自動化機器手臂將試劑點入DNA微陣列晶片上的傳統陣列式儀器讀取微陣列晶片中呈色反應結果的顯微鏡頭成功接合的配對即在微陣列晶片影像中呈現顏色。故已配對成功的待測核草酸排序，即可由標示螢光官能基的核草酸的排序推知。優點•體積小不占空間•能同時快速、大量的處理樣品•可信度及精確性高•分析速度快•可獲得大量整體性且平行化的實驗數據24缺點•技術層次與成本太高•專業訓練人力不足•實驗設備昂貴25應用人體藥物動植物其他•醫療檢驗•法醫鑑定•基因體研究•新藥開發•藥物合成•藥效評估•藥物分析•食品檢驗•動物檢疫•植物品種•病蟲害鑑定•環保應用•國防應用•工安應用26國外基因晶片公司•Affymetrix-全美第一家發展DNA晶片技術的公司，擁有DNA晶片製造技術的專利權，其DNA晶片只能使用一次，不可重複使用。•Nanogen-其產品可在一平方公分的晶片上放上25萬個探針，利用電子吸引力的原理，它們的DNA晶片做hybridization時只需要15秒就可以完成。•Sequenom-利用雷射光激發不同重量的檢品，雷射光經過質量光學測定儀後，可檢定出只有一個分子大小的差別來，因此可做大規模的篩選人類族群中單一核醣核酸的個體差異(SNPs)(singlenucleotidepolymorphisms)。•Illumina-目前號稱探針的密度最高的晶片。可將25萬個探針放在一個類似針頭大面積的晶片上。27國內基因晶片公司•微晶生物科技股份有限公司-國內首家生技公司以多項特有核心技術平台，致力於開發臨床治療用的天然中草藥。專注於具療效草藥基本成份之基因藥理技術平台的建立、脂肪細胞相關疾病及基因醫藥研發、生物資訊工具及系統之開發、基因晶片技術平台與相關產品之開發，以及感染性致病原之分子診斷試劑研發等工作。•晶宇生物科技公司-臺灣第一個以研發製造為導向的生物晶片公司，以提供國內外醫學檢驗及研究市場高品質、低成本的生物晶片產品為目標；並以結合半導體制程之核酸生物晶片開發為長期研發專案的公司。28參考文獻•曾浩洋,蔣育錚.2006.食品病原菌檢測用生物晶片之發展與應用.農業生技產業季刊.online.第7期,51-57•張世忠,呂斯文.2003.生物晶片技術在動植物疫病害蟲診斷鑑定上之應用與未來.農政與農情.online.第128期=4356•生物晶片陳韋凡、胡佳伶、丁秀文、黃鼎皓、鄭雅仁~b881601/biochip/•王少君.2003.第二代生物晶片-微流體晶片與蛋白質晶片.科學發展.online.第369期,74-77