骨髓间充质干细胞（MSCs）生物学特性及其临床应用----常

读书报告-骨髓间充质干细胞（MSCs）生物学特性及其临床应用汇报人：常惠航空航天生理学教研室2008.12.19巨噬细胞成纤维细胞脂肪细胞骨祖细胞内皮细胞网状细胞造血干细胞内皮祖细胞骨髓Mesenchymalstemcells(MSCs)1表面标志物2分化3免疫学特征45治疗应用发现、分离和特征1-1.MSCs发现骨髓中非造血干细胞的存在首先被130年前的德国病理学家Cohnheim发现并提出。Friedenstein的工作（1966）首先证实骨髓中的细胞可以分化成为其它干细胞。二十世纪八十年代其它工作小组研究确定了Friedenstein方法，分离的细胞具有多向分化潜能，可以分化成为各种结缔组织细胞：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞甚至肌原细胞。所以MSCs也被称为间充质细胞或骨髓基质细胞。1-2MSCs的分离人MSCs是在骨髓经密度梯度离心后的单核细胞层中分离出来的，单核细胞在10%胎牛血清中培养，MSCs贴壁。现在MSCs可以从骨髓以外的不同部位：脂肪组织、羊水、骨膜、骨小梁、滑膜、乳牙及胚胎组织分离出来，并呈现表型不均一性。MSCs也可以从妊娠期三个月、六个月的胚胎血液、肝脏、脾脏和骨髓中获得，虽然表型相似，但是培养扩增的MSCs呈现分化潜能的不均一性，这主要取决于组织来源。MSCs可以从很多物种包括小鼠、大鼠、猫、狗、兔子、猪和狒狒中分离出来，但是成功率不尽相同，例如移去小鼠的造血细胞是很困难的。通过扩增和传代MSCs可以纯化细胞，培养结果仍会存在形态不均一性，包括长的纺锤形、大的多边形细胞，形成汇合后还会存在一些小的立方细胞。成年人的MSCs都是从骨盆髂骨中抽吸获得，也可以从胫骨和股骨骨腔，胸椎、腰椎中获得。大型动物MSCs都是从固定的部位获得，如啮齿类都是从股骨和胫骨的中骨干中获取。常规细胞培养技术可以扩增MSCs。形态学呈现成纤维细胞样，原代培养持续12-16d，这段时间可以去除造血干细胞。培养的细胞并不一定是纯净的，有报道称表达CD45和CD11b的B细胞祖细胞、粒细胞和单核细胞祖细胞在培养过程中都会一直存在。2MSCs表面标志MSCs表达很多表面标志，但是很多都不是MSCs特异性的。人和不同动物的MSCs并不表达相同的分子，例如人和大鼠MSCs表达CD34阴性，有些文献报道其它鼠类CD34有不同程度表达。被广泛接受的是MSCs缺乏造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31，而且离体和在体MSCs表达的一些标志分子并不相关。组织来源、分离培养方法、种属的不同的MSCs标志物有所不同。这些抗原并没有特异性，在其它类型的细胞中也有表达，所以仍是研究内源和移植MSCs细胞增殖、运动和定位机制的障碍。3MSCs分化3-1MSCs向骨细胞分化使MSCs向骨组织分化的经典方法是用抗坏血酸、β-磷酸甘油、地塞米松孵育汇合生长的单层MSCs细胞2-3周。这些MSCs形成集落且碱性磷酸酶表达升高，随着时间延长发生钙蓄积，茜红素染色阳性。3-2MSCs向脂肪细胞分化MSCs培养与地塞米松、胰岛素、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤孵育可诱导向脂肪细胞分化。在细胞内脂肪泡积累，并且表达过氧化物酶体增殖-活化受体γ2、脂蛋白酶和脂肪酸结合蛋白aP2。最终脂肪泡融合并且填满细胞，可用油红染色检测。3-3MSCs向肌细胞分化1982年TaylorandJones首先报道了5-Azacytidine诱导MSCs向胚胎和成年肌细胞分化；1999年Phinney指出两性霉素B作用于小鼠MSCs可以导致类似肌管的多核肌纤维的形成，并产生节律收缩性。体外诱导MSCs向心肌细胞分化的RT-PCR结果3-4MSCs向神经样细胞分化小鼠MSCs来源的成骨细胞和MSCs自身在神经生长因子和5-氮胞苷的作用下会成为神经细胞形态表达成熟神经元的特异性标志。这些神经样细胞缺乏产生动作电位的电压门控离子通道，因此不能称作真正意义上的神经元。3-5MSCs向软骨细胞分化MSCs向软骨细胞分化需要以下条件：三维培养模式，无血清营养培养基，加入TGF-β成分。当这些条件都具备时，MSCs会丧失其成纤维样形态而开始表达大量软骨特异性胞外成分，包括大量的糖胺聚糖生物合成，伴随细胞形态的明显改变。MSCs分化为软骨细胞表达的SH-3和SH-4表面抗原-流式结果硫酸化软骨素在诱导培养初期的改变3-6其它最近研究显示MSCs可以分化为内皮样细胞并促进血管形成。其后又有研究显示直接给成年心脏中注入MSCs可以分化为心肌细胞、内皮细胞、血管周膜细胞和平滑肌细胞。4免疫学特征MSCs的免疫表型(MHCI+，MHCII-，CD40-，CD80-，CD86-)不具有免疫原性，因此移植入同种异体宿主不会发生免疫抑制。MHCclassI可以激活T细胞，但是如果没有共刺激分子，第二信使不会应答，T细胞无反应性。MSCs有免疫抑制性，离体人MSCs抑制T细胞增殖、分化和在趋化过程中发挥免疫调节作用。最近，对实验性自身免疫性脑脊髓炎（一种多发性硬化模型）小鼠给予全身注射MSCs，这种疾病由自身反应性T细胞介导，结果可使病情得到极大的改善，因此将MSCs定位于炎症组织可以通过其免疫抑制活性产生治疗作用。5MSCs的治疗应用MSCs具有高扩增能力，遗传稳定性，易收集便于运输，并可以配合不同的传输方法。有两项重要特征使其具有自体和异体移植的高成功率：迁移到组织损伤位点并产生强免疫抑制活性。成年干细胞是修复性细胞的储存库，在损伤和疾病信号的刺激下随时可以移动并分化。干细胞治疗包括给病人移植自体和同种异体干细胞，可通过局部注射和全身灌注。在以前有造血干细胞移植治疗白血病和其它癌症的先例，最近大量骨髓来源MSCs移植的报道显示其应用广泛，包括心血管修复、肺纤维化治疗、脊椎损伤和骨、软骨的修复。5-1移植细胞与宿主相互作用1）宿主对移植细胞的免疫反应2）移植细胞定位于宿主损伤部位机制3）在局部信号的刺激下移植细胞分化5-2MSCs在心血管疾病中的应用（5个实验）5-3MSCs在其它疾病中的应用（3个实验）5-4问题和风险5-1移植细胞与宿主相互作用1）宿主对移植细胞的免疫反应MSCs抑制混合淋巴细胞反应，包括同种自体和同种异体T细胞或树突状细胞。照射过的外周血淋巴细胞、树突状细胞或植物凝集素可以刺激人T细胞增殖，但在培养中可被MSCs抑制。MSCs的在治疗应用方面的好处很多，但是也有不足的地方，就是病情有从供体转移到宿主的潜在风险。2）移植细胞定位于宿主损伤部位机制静脉注射MSCs会导致细胞向损伤位点迁移，这种特殊能力可以在骨折、心肌梗死和缺血大脑损伤中发现。单核细胞趋化蛋白MCP-1可以促进MSCs向脑缺血损伤部位的迁移，MCP-1在大脑动脉阻塞的大鼠中表达会上调，这就是MSCs的趋化性。很多研究证据表明MSCs可以定位于组织，特别是受伤或炎症时会穿过内皮层。定位组织并迁移穿过内皮的机制尚不了解。但是损伤组织会表达特异性配体或受体促进损伤部位MSCs的运输、黏附和渗透，就像白细胞会聚集于炎症反应部位一样。趋化因子的受体及其配基是白细胞迁移至炎症部位的主要成分，最近报道MSCs也表达这些分子。白细胞迁移穿过内皮表达的黏附分子在MSCs中也有表达。3）在局部信号的刺激下移植细胞分化干细胞治疗的基本原理是未分化细胞向宿主受损伤部位的迁移，在局部信号的刺激下，分化成为合适的形态。但是只有证据证明这种现象而没有关于原位分化的特异信号数据。如移植细胞治疗骨质缺陷如股骨大裂缝，从放射学和组织学可以测定新骨形成。4）疾病中的干细胞疾病中成年干细胞的作用是在某些退行性环境中，发生进一步组织损伤并失去修复能力，可能是由于干细胞群体衰竭或功能改变。5-2MSCs在心血管疾病中的应用1）心脏疾病心梗后的心肌缺失导致心肌收缩机能障碍引起心肌死亡并纤维化最终形成伤疤组织，在大多数情况下梗死会引起慢性长期心肌缺血导致结构重建失败引起心衰和死亡。胚胎心肌细胞或骨骼肌肌原细胞移植在未来是提高心输出量的方法。但是这个想法很难实施因为获得供体细胞的难度和移植心脏后生理功能充分恢复的失败率。实验一一些研究者指出冠脉内注射MSCs将是心脏病治疗的一种简单和成功的方法。2002年有一项有趣的研究，20位透壁性梗塞病人参加，进行左右导管插入术和冠状动脉血管造影术后，病人又经历了气囊血管成形术和支架移植。在急性梗死5-9d后，从十个病人的髂骨处穿刺取出骨髓，用Ficoll法分离单核细胞，用导管移植入梗死区，细胞将会定位在梗死相关动脉处。冠脉内移植是由6-7次高压灌注完成，每次需要1.5-4X106个细胞。离体实验显示这些细胞可以在培养中产生间充质。三个月后对细胞移植组和常规治疗组进行对比发现一些显著差异。细胞移植组的左心室梗死区运动机能减退明显降低，两组的射血分数都增加，细胞疗法的灌注缺损明显降低。实验二69位心梗病人在12h内接受血管造影术和血管成形术，随机选出34为病人接受MSCs移植，其余35位是冠脉介入后的生理盐水注射组，从病人抽取60ml骨髓并培养10天后获得MSCs，进行细胞治疗。梗死区动脉在血管成形术早期阻塞，注射6ml8-10X106/mlMSCs细胞悬浮液后，对照病人接受常规盐水注射。所有病人一个月接受一次超声心动扫描，并在移植后3个月和6个月进行一次正电子发射断层扫描摄影。治疗3个月后进行一次24h心电图监测。细胞治疗的梗死区室壁运动速度明显增加，左心室射血量增加。实验三一个有趣的随机试验叫做BOOST实验，证明冠脉转入自体骨髓细胞治疗急性心梗的有效性，60位患急性心梗的病人参加，冠脉介入后，病人被分为传统治疗组和细胞治疗组，从病人收集骨髓细胞用于治疗，在介入4-8d后冠脉注射MSCs，左室舒张末期容积，左心室体积指数，左心室收缩末期压在两组之间无明显差异，但是细胞治疗组左心室射血分数和收缩期室壁运动比对照组增加，值得注意的是在6w、3m、6m后两组之间并没有过早的心室综合波以及持续和非持续的心动过速发生。研究者认为自体MSCs移植可以促进心梗病人左心室功能的恢复。还有一种心梗的不同治疗途径，冠脉内移植自体骨髓来源的单核细胞可以提高梗死心脏的收缩性，由于细胞未纯化，所以含有大量已定性的分化细胞，有人认为骨髓间质中的内皮祖细胞可能会促进梗死心肌的肌形成和血管发生。实验四研究者招募了前间隔心肌梗死的新老病人，对所有病人前降动脉进行血管成型术和支架移植，11个病人在冠脉介入后提取骨髓来源的单核细胞，培养7d后收集贴壁细胞带入手术室，左冠状动脉插入导管进行细胞移植，收缩末期和舒张末期血管内径，射血分数，收缩末期容积，舒张末期容积在细胞移植和对照组均有改善，其中5位病人失活的心肌部分心肌收缩力明显提高，而对照组无此变化。综上所述梗死心肌移植自体来源的骨髓细胞是一种安全可行的促进梗死心肌再生的方法，仍有一些看法存在争议：什么样的干细胞适合病人？移植的最佳时机？移植细胞活力怎样监测？干细胞活性发挥的最终机制是生长因子的分泌还是细胞与细胞的相互作用？实验五一项研究发现给末期缺血心脏病人移植骨髓来源的单核细胞会促进新生血管形成，并预防心功能疲劳引起的心肌梗死，21位病人参加实验，14位接受细胞疗法，7位对照，病人选择的标准是：A慢性冠脉疾病，B左心室射血分数小于40%，C接受过外科血管成形术手术的患者不能参加。给病人注射50ml骨髓单核细胞，导管插入心脏左侧。治疗2m后，可逆性缺损明显降低并伴随左心室功能显著改善，4个月后显示射血分数明显改善且收缩末期容积降低。相同的研究小组进一步给严重缺血6-12m的病人内镜注射自体骨髓细胞，可逆性损伤降低，细胞治疗12个月后运动能力明显升高。2）血管疾病动脉狭窄是人体血管成形术和动脉切开术以及动物实验性血管损伤的病理现象，引起动脉腔不同程度的阻塞，需要通过血管成形术治疗改善。血管损伤是内膜和中膜细胞丧失以及弹性纤维层组织损伤，导致血管平滑肌细胞严重的的病理修复和重塑，最终导致新生内膜的异常增生。最近研究发现血管功能不仅依赖血管内细胞，还很大程度受到骨髓来源的循环细胞的调节，损伤的内皮和动脉介质的再生取决于临近