鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究

中国农业科学2005,38(10):2129-2133ScientiaAgriculturaSinica收稿日期：2004-07-28基金项目：国家自然科学基金(30270998)和江苏省自然科学基金(Q200443)资助作者简介：张建峰（1976-），男，博士研究生，主要从事畜禽骨骼生物学研究。E-mail:[e-mail]。侯加法为通讯作者，Tel：[phone];E-mail：[e-mail]鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究张建峰，侯加法，张皎，姚静(南京农业大学动物医学院，南京210095)摘要：应用RT-PCR方法对雏鸡肝脏总RNA中鸡类胰岛素生长因子Ⅰ基因cDNA进行扩增，然后将特异性片段连接到pMD18-T载体，测序结果表明，与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达，经Tricine-SDS-PAGE分析，原核表达产物为7.6kD的重组蛋白，占菌体总蛋白的23%，Western印迹表明重组蛋白具有IGF-Ⅰ抗原活性。表达产物以包涵体形式存在，经7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及0.5mol·L-1精氨酸复性液处理，表达产物随后进行脱盐、凝胶层析纯化、MTT法分析其对NIH3T3和鸡胚成骨细胞的增殖效应，结果表明重组鸡IGF-Ⅰ具有较高的生物学活性。关键词：鸡；类胰岛素生长因子Ⅰ基因；原核表达；MTT法TheCloning,ExpressionandBioactivityResearchofRecombinantChickenIGF-ⅠZHANGJian-feng,HOUJia-fa,ZHANGJiao,YAOJing（CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095）Abstract:Withthereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR),theDNAsequenceencodingthechicken’sinsulin-likegrowthfactorⅠ(IGF-Ⅰ)wasamplified,whichwasthenclonedintovectorpMD18-Tandsequenced.Thesequencingresultshowedthattherewas100%homologyamongthedocumentedsequencesandsequencereportedhere,whichwassuccessfullyinsertedintotheexpressingplasmidpRLCandwashighlyexpressedinEcoli.TheTricine-SDS-PAGEresultshowedthattheclonedrecombinantproteinexpressedintheformofinclusionbodiesintheE.colicellwithmolecularweightof7.6kDandamountedto23%ofthewholeproteinintheE.colicell,andWesternblottingindicatedthatrecombinantproteinhadtheantigenicityofIGF-Ⅰ.Theinclusionbodiesweresubsequentlydissolvedin7mol·L-1guanidinechlorideandrenaturedwithdilutioninrefoldingbuffercontaining0.5mol·L-1arginine.Inordertoobtainpureprotein,therenaturedchickenIGF-ⅠwasdesaltedbyHiprep26/10andpurifiedbyHiprepSephacrylS-200chromatography.ThebiologicalactivitiesofIGF-ⅠproductwasassayedinNIH3T3cellsandosteoblasticcellsofembryonicchickenbyusingMTTmethod.TheresultsshowedthattheexpressedIGF-ⅠobviouslystimulatedNIH3T3cellsandosteoblasticcellstoproliferateattheconcentrationrangingfrom0.1mg·ml-1、0.2mg·ml-1、0.4mg·ml-1、0.8mg·ml-1,suggestingthattheproteinhasitsbiologicalactivities.Keywords:Chicken;Insulin-likegrowthfactorⅠgene;Prokaryoticexpression;MTT胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是由70个氨基酸残基组成的单链碱性多肽，分子量7.6kD。在一级结构上与胰岛素原有较高的同源性，而且在不同的生物种属之间遗传保守性极高，如人、牛、猪的IGF-Ⅰ完全相同。IGF-Ⅰ作为骨骼细胞分泌的重要生长因子，为骨源性生长因子(BDGF)成分之一，以自分泌、旁分泌的形式调节成骨细胞功能、参与骨重建[1,2]。同时IGF-Ⅰ也是各种组织细胞有丝分裂原，包括成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等，对成骨细胞有中等促进有丝分裂作用[3]。2130中国农业科学38卷国内外至今未见有关鸡IGF-Ⅰ单纯表达及重组鸡IGF-Ⅰ与骨相关研究的报道。本实验室在成功建立鸡胚额骨成骨细胞的培养方法的基础上[4]，通过对鸡IGF-Ⅰ基因进行克隆、原核表达，旨在获得有显著生物学活性的鸡IGF-Ⅰ成熟蛋白，为进一步研究重组IGF-Ⅰ对体外培养鸡胚成骨细胞骨相关基因(COLⅠ、IGF-ⅠR、BGP、OPG)表达水平的影响打下坚实的基础；同时成熟IGF-Ⅰ的获得及应用也有助于从分子水平阐明IGF-Ⅰ调节系统在骨重建、骨转化及笼养蛋鸡骨质疏松症中的作用机制，为防治蛋鸡骨质疏松提供理论依据。1材料与方法1.1材料大肠杆菌DH5α、原核表达载体pRLC和NIH3T3由南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存，pRLC带有PR和PL启动子，温敏诱导表达。限制性核酸内切酶EcoRⅠ、PstⅠ、T4DNA连接酶、ExTaq酶、核酸分子量标准、pMD18-T载体等购自大连Takara公司，M-MLV反转录酶购自Promega公司，蛋白质分子量标准购自中科院上海生物化学与生物细胞研究所。兔抗人IGF-Ⅰ抗体和羊抗兔IgG-HRP购自武汉博士德生物技术公司。DMEM为GIBCO公司产品，脱盐柱Hiprep26/10Desalting和分离柱HiprepSephacrylS-200为Pharmacia公司产品。1.2方法1.2.1chickenIGF-ⅠcDNA片段的克隆及测序根据GenBank上登录的chickenIGF-ⅠcDNA序列(M-32791)；设计了两对引物，引物P1和P2用于扩增完整的基因(包括48个氨基酸残基构成的信号肽序列)，引物P3和P4用于扩增鸡IGF-Ⅰ成熟蛋白(IGF-mⅠ)。P3引物在编码chickenIGF-Ⅰ成熟蛋白的第一个密码子之前加入了一个EcoRⅠ酶切位点和ATG起始密码子，P4引物与cDNA3′端互补，并加入了一个PstI酶切位点和TAA终止密码子。P15′-TCTCAACATCTCACATCTCTCTG-3′P25′-GATGGCATGATCTTACATTCTG-3′P35′-GAATTCATGGGCCCAGAAACACTGT-3′P45′-CTGCAGTTATGCACATTTAGGTGGCTT-3′Trizol法一步提取雏鸡肝脏总RNA，用RT-PCR和PCR法分别扩增chickenIGF-Ⅰ和chickenIGF-Ⅰm。反应产物经1%琼脂糖电泳鉴定、回收和纯化，分别连接到pMD18-T载体上，命名为pMD18-T-IGF-Ⅰ和pMD18-T-IGF-Ⅰm，送上海博亚生物技术公司测序。1.2.2鸡类胰岛素生长因子Ⅰ原核表达载体的构建参考分子克隆第三版[5]，将原核表达载体pRLC和chickenIGF-Ⅰm用EcoRⅠ+pstⅠ双酶切，回收片段用T4DNA连接酶4℃连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞，挑菌培养，提取质粒，用EcoRⅠ+pstⅠ双酶切及PCR鉴定阳性克隆。1.2.3菌株的诱导表达及表达产物的免疫印迹分析阳性工程菌在含氨苄青霉素（50µg·ml-1）的LB培养基中，30℃振荡过夜，次日以2%量接种2×YT培养液扩大培养，30℃继续培养3～4h,当OD600约等于0.4～0.6时，快速变温至42℃，诱导表达6h，进行Tricine-SDS-PAGE分析及薄层扫描。将诱导表达后的重组蛋白转印至硝酸纤维素膜（NC膜）上，以5%BSA封闭，与一抗结合，洗涤后与酶标二抗反应。其中抗原抗体反应中的第一抗体为兔抗人IGF-Ⅰ多抗（1∶200），酶标第二抗体为羊抗兔IgG-HRP（1∶50），DAB显色。1.2.4表达产物的提取、复性和纯化(1)包涵体的制备：将1L诱导表达菌液5000r/min离心15min收集菌体，用PBS洗涤两次后用生理盐水重悬，冰浴超声破菌，每次超声30s，静置30s，反复共16min。1500r/min离心15min，弃上清得包涵体，再用包涵体洗液(1%TritonX-100，50mmol·L-1Tris-HClpH8.0，10mmol·L-1EDTA，0.15mol·L-1NaCl)洗涤3次，得到初步纯化的包涵体。(2)表达产物的变性、复性[6]和纯化：上述洗涤的包涵体溶于包涵体裂解液(7mol·L-1GdmCl，50mmol·L-1Tris-HClpH8.0，0.2mmol·L-1EDTA，50mmol·L-1DTT)室温搅动2h，离心取上清，用包涵体裂解液将上清浓度调整为100mg·ml-1。在冰浴条件下分别将包涵体裂解液分两次注入搅动的复性液，至蛋白质终浓度为0.2mg·ml-1，4℃静置过夜。复性液基本成分是100mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0）、0.2mmol·L-1EDTA、0.5mmol·L-1L-精氨酸。再将复性液置于透析袋内透析24h，离心10000r/min15min，收集上清，浓缩后经0.45µm滤膜过滤，测定蛋白含量。最后经SephacrylS-200层析柱分离纯化IGF-Ⅰ，洗脱液为PBS（pH7.4），收集主峰。1.2.5常规MTT法[7,8]检测重组IGF-Ⅰ成熟蛋白的生物学活性取NIH3T3细胞、第3代鸡胚额骨成骨EcoRⅠpstⅠ10期张建峰等：鸡类胰岛素生长因子Ⅰ的克隆、表达及其表达产物的生物学活性研究2131细胞分别以2×105个/ml、3×104个/ml接种100µl于96孔板培养，分别培养24h、72h后，分别加入重组鸡IGF-Ⅰ蛋白。试验各分8组，每组6个重复，各组中IGF-Ⅰ分别加入：0(对照组)、0.01ng、0.1ng、1ng、10ng、20ng、40ng、80ng。培养24h、72h后，换无血清培养液，并于每孔加入30µl（2mg·ml-1）MTT，4h后吸尽培养基，各加150µlDMSO，振荡10min，分别于UV490、570测光吸收值。2结果与分析2.1鸡类胰岛素生长因子Ⅰ基因的克隆、亚克隆及测序结果以雏鸡肝脏提取的总RNA作反转录模板，经RT-PCR、PCR获得chickenIGF-I基因和chickenIGF-m基因，测序结果表明，克隆chickenIGF-1基因、chickenIGF-1m基因大小分别为562、228bp（电泳结果如图1、2），与设计相符。1、2.IGF-Ⅰ基因;3.空白对照;4.总RN