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实验须知1．实验前必须认真预习实验内容，熟悉本次实验的目的、原理和操作步骤，并思考每一操作步骤的意义。未预习以及未听教师讲解实验内容的同学不得参加实验操作。2．自觉遵守课堂纪律，不迟到，不早退；自觉维护实验室秩序，不大声谈笑，手机设为静音。3．实验动物是本实验课的主要研究材料。对实验动物一定要有尊重爱护的态度，严禁逗耍实验动物以及用手机给动物拍照，严禁将实验动物掉在地上，严禁乱扔实验动物，切实保障操作者自身和其他同学的人身安全，以及避免实验动物的意外受伤。若不慎被动物抓伤或咬伤，应立即报告指导教师，并及时进行妥善处理。4．实验过程中要听从教师的指导，注意力高度集中、严肃认真地按操作规程进行实验，仔细观察并分析实验现象，并把实验结果和数据及时、如实地记录在实验报告上。5．使用药品、试剂等时必须注意节约；要爱护实验室的仪器设备，严格遵守操作规程，小心仔细，防止损坏仪器。发现故障须立即报告教师，不可擅自动手检修。6．实验完毕，应将试剂、药品摆放整齐，仪器洗净放好，将实验台面擦拭干净，使实验室始终保持干净卫生，动物尸体由教师按实验室操作规范统一处理。离开实验室前，应将自己的手清洗干净，养成良好个人卫生习惯。7．完成实验后，应按要求及时完成实验报告，并由学习委员交给指导教师。实验一实验动物的一般操作技术一、实验目的学习食品毒理学试验中有关动物试验的基本操作技术，掌握实验动物的选择，性别鉴定，抓取方法，标记方法，染毒方法，生物材料采集和实验动物处死等技术。二、试剂、器材及动物苦味酸酒精饱和溶液、美蓝溶液、0.9％的NaCl溶液托盘天平、电子天平、棉签、1mL注射器、灌胃器、烧杯、容量瓶、定量取血管、玻璃毛细管、鼠笼昆明种小鼠三、操作方法（一）实验动物的选择食品毒理学研究中，无论应用何种种属、品系的实验动物，都必须是健康动物。动物的选择，应重点检查下述项目。1.外观体形丰满，被毛浓密光顺，行动敏捷，反应灵活。2.眼睛明亮，瞳孔清晰，双侧等圆，眼内无分泌物，眼睑无肿胀、发红。3.耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮、糜烂。4.鼻无喷嚏，无浆性黏液分泌物。5.皮肤无创伤、脓疮、疥癣、湿疹。6.头颈部姿势端正。颈项歪斜提示可能存在内耳疾患，不能用于实验。7.消化道无呕吐、便秘、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。8.神经系统无震颤、麻痹、运动失调，如有转圈运动或倒提时呈圆圈摆动，不能用于实验。9.四肢及尾四肢、趾及尾无红肿、溃疡。10.食欲及营养良好（二）实验动物的性别鉴定1.大鼠、小鼠主要观察肛门与生殖孔的间距，雄性间距大，而雌性间距小；雄鼠夏天或卧位可见睾丸，雌鼠腹部有明显乳头，大鼠6对，小鼠5对。（三）实验动物的抓取和固定实验前应了解动物的一般习性，正确抓取和固定动物，既要大胆，又要细心。1.小鼠的抓取方法先用右手抓取鼠尾部提起，置于实验台上向后拉，在其向前方爬行时，用左手拇指和食指快速、准确抓取小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手手心中，以无名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。右手则可进行灌胃或注射等操作。（四）实验动物的称重、编号和标记1.称重一般同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的10％，组间同性别动物体重平均值相差应小于5％。2.编号和标记（1）染色法一般采用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位的被毛染色，表示不同号码，此法适用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用的染料有苦味酸酒精饱和液（黄色）、美蓝溶液（蓝色）或甲基紫酒精饱和液、0.5％中性红或品红溶液（红色）等。具体方法为：头部为1号，按顺时针方向，右前肢2号、右肋3号、右后肢4号、尾跟5号、左后肢6号、左肋7号、左前肢8号、背部9号；在相应部位涂染另一种颜色染料表示十位，两种颜色可编1~99号。（五）实验动物的染毒途径和方法1.经口染毒（1）灌胃将毒物不经口腔和食道，直接灌入胃内。急性毒性试验多用此法。具体方法：用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部。将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。进针深度一般是小鼠2.5～４cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。（2）喂饲将受试化学物均匀拌入饲料或溶于饮水中，由动物自由采食。适用于染毒时间较长的毒性试验，如亚慢性和慢性毒性试验。（3）吞咽胶囊将所需剂量的受试化学物装入胶囊内，强制动物咽下。适用于易挥发、易水解和有异味的化学物，兔、犬、猫可用此法。2．注射染毒外源化学物的毒性研究中，根据试验目的和需要，可选择腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等途径染毒。大鼠和小鼠经尾静脉注射，兔则经耳静脉注射。（六）实验动物生物材料的采集和制备毒理学研究中，常常需要采集动物的血液、尿液或组织，测定外源化学物或其代谢物的浓度。因此，生物材料的采集和制备是毒理学研究重要的基本操作技术。1．大、小鼠采血（1）鼠尾采血。适用于用血量较少的试验。固定动物后，将鼠尾浸入45~50℃温水，使尾静脉充血，擦干，用酒精棉球消毒。将尾尖剪去约2~3mm,拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管内加抗凝剂与否，依试验需要而定）吸取定量尾血，然后用干棉球压迫止血。如需要多次采血，可用火棉胶涂封，下次采血时去掉火绵胶。鼠尾采血亦可用1ml注射器连接5~6号针头直接刺入尾静脉定量采血（鼠尾明显可见四条血管，上下两条为动脉，左右两条为静脉）。（2）眼眶静脉丛采血。操作者以左手拇指、食指抓住鼠两耳之间的皮肤，并轻压颈部两侧使眼球充分外突，眶后静脉丛充血，为防止动物窒息死亡，用力要恰当。右手持玻璃毛细管（长7~10cm,内径1.5mm）从一侧眼内毗邻部以45度角向眼后方向刺入，捻转前进。如无阻力可继续刺入，有阻力则抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止，小鼠大约2~3mm，大鼠大约4~5mm。收集血液后，拔出毛吸管，用干棉球压迫止血。本法短期内可重复采血，采血量小鼠一般为0.2~0.3ml，大鼠0.5~1ml。（3）摘眼球采血。保定方法同（2）。动物倒立，使眼球外突充血，用小镊迅速摘掉眼球，将血液滴入事先备好的容器内。此法用于鼠类大量采血，仅使用一次。（4）断头采血。操作者一手握住动物，另一手持剪刀或断头钳快速断头，倒立动物将血液滴入容器，注意防止断毛落入容器中。用于大鼠、小鼠。（七）实验动物的处死方法1.颈椎脱臼法多用于小鼠，一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎脱臼，立即死亡。2.断头法用于大鼠和小鼠。保定者一手按住鼠头，另一手握住背部，露出颈部，助手持大剪刀或断头器剪断颈部，使之死亡。此法不引起血浆皮质酮、儿茶酚胺升高，常用于血液及化学成分、组织酶测定。3.击打法适用于较小的动物。抓住鼠尾、提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡；也可用器具击打动物头部，使其致死。前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。4.其他电击法、枪击法、微波法等。动物处死方法多种多样，原则是根据实验需要进行选择，同时尽量消除动物在试验过程中所致的疼痛和不适，遵守动物试验的职业道德。四、作业注明自己小组所选择实验动物的性别、体重及编号（画图说明）；以及用专业术语描述小鼠粪便的颜色和形状。五、注意事项１.对实验动物要有尊重爱护的态度，实验操作必须严肃认真，注意力高度集中。２.正确抓取动物，防止被咬伤；严禁乱扔小鼠；防止将小鼠掉在地上。实验二亚硝酸盐的急性毒性观察一、实验目的和原理急性毒性是机体一次接触或24h内多次接触较大剂量外源化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应。亚硝酸盐是食品毒理学中常见的一种化学毒物，通过采用不同途径对小鼠染毒，观察其对毒性的影响及亚硝酸盐急性毒性反应的特征。二、试剂、器材及动物亚硝酸钠溶液（10mg/mL）托盘天平、电子天平、容量瓶、烧杯、注射器、灌胃针、鼠笼、酒精棉球成年健康小鼠100只（雌雄各半）三、试验方法（一）健康动物的选择及性别鉴定（二）动物称重（三）亚硝酸盐溶液的配置（四）灌胃1．动物的禁食和复食由于外源化学物质进入胃内后易受胃内容物作用而降低毒性，胃充盈时其内容物还可影响受试溶液的灌入和吸收，因此灌胃前应禁食6~10h，使动物既保持空腹状态，又不至禁食时间过长，否则动物长期饥饿会影响肝脏，进而影响实验结果。动物灌胃后至少2~3h后才能复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长。2.灌胃液浓度和容量相同剂量的受试化学物，若给以不同浓度可能会产生不同的死亡情况。灌服体积大小亦可影响试验结果，体积太小，太浓，可能产生局部刺激或其他损伤；体积太大，可能引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。经口急性毒性试验中，常常是固定受试化学物体积，根据试验设计的剂量用1：K系列稀释法将受试化学物配制成不同浓度的液体剂型灌胃。其灌胃体积以体重的1%~2%计算，最多不超过3%，即小鼠每10g体重灌胃0.1~0.2ml，最多不超过0.3ml，根据实际经验得出灌胃量的极限是，小鼠0.5~1ml；大鼠1~4ml；豚鼠1~5ml；家兔5ml;鸡10ml/kg和犬50ml/kg。3.灌胃操作技术主要有小鼠、大鼠及豚鼠灌胃法。用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部；②大鼠、豚鼠保定，一手抓住大鼠、豚鼠双耳后至背部皮肤。均将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。进针深度一般是小鼠2.5～４cm，大鼠或豚鼠４～６cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。（五）静脉注射染毒四、中毒症状观察１.中毒症状染毒后认真观察中毒发生、发展过程，中毒特点和毒作用靶器官。观察期间每3d称重一次，对死亡动物和实验结束时的存活动物全部称重，做大体病理学检查，取病变组织做病理组织学检查，为亚慢性、慢性和其他毒性试验剂量和观察指标选择提供参考依据，并按表2-1做好记录。表2-1急性毒性试验观察原始记录组别动物编号性别体重（g）染毒计量（mg/kg）染毒时间症状及出现时间死亡时间体重纪录（g）实验记录者：记录日期：２.LD50计算根据受试动物种类确定计算方法，如改良寇氏法、概率单位法、Bliss法等，并在实验前设计计量分组和每组动物数，按选择方法求出LD50及其95％的可信限范围。如毒性反应存在种属或性别差异，应分别求出不同种和不同性别动物的LD50。五、结果评定根据实验动物的中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用特点，按受试化学物种类分别参照相应化学物经口急性毒性分级标准进行评定，初步判断该受试化学物的毒性大小及毒性特征。六、作业完成急性毒性原始记录表，并简要分析不同途径染毒毒性差异的原因。七、注意事项１.防止操作者中毒。２.剩余受试化学物和实验动物应在教师指导下处理。实验三小鼠精子畸形试验一、实验目的精子畸形试验是检测受试化学毒物能否破坏哺乳动物精子正常形态的试验方法。通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形试验的原理和步骤。二、实验原理精子畸形是指精子的形状异常和异常精子的数量增多。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应前，生殖系统可能已出现了损害作用。正常情况下，哺乳动物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化学毒物的作用下，特别是在可引起生殖细胞遗传性损伤的化学毒物的作用下，哺乳动物睾丸产生的畸形精子数量可大量增加。因此，可以用检测雄性动物接触化学毒物后精