鱼类虹彩病毒 生化、分子生物学及功能基因组学研究进展

鱼类虹彩病毒:生化、分子生物学及功能基因组学研究进展滕勇，秦启伟*中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州（510275）E-mail：[e-mail]摘要：鱼类虹彩病毒是一类新近爆发和流行，严重感染鱼及其他水生动物的重要致死性病毒病原之一。本文从形态、生理生化、分子生物学及基因组学等多个方面，简要综述了鱼类虹彩病毒的研究进展，并重点介绍了作者所在实验室对新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus,SGIV)的最新研究进展。旨在为虹彩病毒的功能基因组学研究，研究病毒感染致病的分子机理，以及发现新的宿主抗病毒功能基因，建立准确高效的检测方法以及研制有效的抗病毒药物和疫苗提供借鉴。关键词：鱼类；虹彩病毒；分子生物学；功能基因组学近年来随着养殖品种的增多和养殖规模的扩大，各种传染性疾病不断爆发和流行，已严重制约了水产养殖业的健康可持续发展。据世界银行估计，每年全球由于病害而导致的水产经济损失高达30亿美元。我国是水产养殖大国，全国各种养殖品种每年发病率均在50％以上，而死亡率高达20％以上，直接造成的经济损失每年超过百亿元人民币。在各种传染性病原中，病毒是最重要的致病病原，它可以对从幼苗到成体不同发育阶段的养殖品种造成90％以上的死亡率。目前已经从鱼类中分离出60多种病毒，而其中分属于7个科的20多种病毒是严重的流行性致病病原。虹彩病毒(Iridovirus)就是近年来新出现的一种最严重的鱼类传染性病毒之一，在世界各地已从30多种鱼类中分离鉴定出虹彩病毒。它可以造成鱼类的死亡率从30%（在成鱼中）到100%（幼苗阶段）。这种病毒在亚洲，特别是在22度以上的高水温时，极易感染中国、日本和东南亚等国养殖的海水名贵鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，致使鱼类大面积的死亡，造成了严重的经济损失，因而被称之为“海洋口蹄疫”。虹彩病毒科(Iridoviridae)目前分为4个属：感染脊椎动物的蛙病毒属(Ranavirus)和淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)，以及感染无脊椎动物的虹彩病毒属(Iridovirus)和绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)[3,4]。已报道的水生动物虹彩病毒病原中，有来源于鱼类的流行性造血器官坏死病毒(Epizootichematopoieticnecrosisvirus,EHNV)、真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)、非洲鱼虹彩病毒(Africanlampeyeiridovirus,ALIV)、虹鳟鱼病毒(Rainbowtroutvirus,RTV)、欧鲇病毒(Europeansheatfishvirus,ESV)、欧洲鲶鱼病毒(Europeancatfishvirus,ECV)、大口鲈鱼病毒(Largemouthbassvirus,LMBV)、石斑鱼虹彩病毒(Grouperiridovirus,GIV)、大黄鱼虹彩病毒(largeyellowcroakeriridovirus,LYCIV)。也有来源于两栖类的饰纹汀蛙虹彩病毒(Bohleiridovirus,BIV)、蛙虹彩病毒(Ranagryliovirus,RGV)、虎纹蛙病毒(Tigerfrogvirus,TFV)以及来源于爬行类的TV3(Boxturtle3)和TV5(Tortoisevirus5)等。1虹彩病毒病原的生物学研究虹彩病毒在提纯、浓缩或结晶后，呈正20面体，直径在120-300纳米，脂质体双层外壳膜包围着一个圆形的脱氧核糖核酸-蛋白体电子致密核。它是一类细胞质DNA病毒，其基因组为线状双链DNA单分子，大小为110-200kb，相对分子质量为130×106，G+C比例为29%-58%，核酸重量占病毒粒子总重量的15%左右[15,16]。病毒粒子在从宿主细胞的细胞质膜出芽释放（Budding）的过程中，获得外层囊膜。虹彩病毒的抵抗力较强，感染培养物于23℃可以存活几个月，置于-20℃以下保存，则可存活20个月左右。它能耐受低pH和反复的冻融处理，对乙醚或氯仿等脂溶性溶剂敏感，不能保存于50%的甘油中。2流行病学研究2.1致病性病毒主要通过以下两种途径对机体造成损伤，一是直接作用于宿主细胞，二是通过引发免疫应答异常而使宿主细胞损伤[15]。2.1.1病毒感染对宿主细胞的影响病毒浸染宿主后，能够在宿主细胞内编码产生一些酶类物质来抑制宿主细胞的核酸复制和蛋白质合成，从而使细胞因正常代谢受阻而死亡。病毒还能使细胞溶酶体膜遭受破坏，引起溶酶体酶外溢，致使细胞产生自溶现象。随着病毒的大量复制，细胞开始裂解，释放出大量的病毒粒子，这些释放出的病毒粒子又开始感染更多的细胞，最终导致机体的功能衰退，引发细胞死亡。2.1.2病毒感染的组织病理变化在虹彩病毒的流行暴发中，发病大多迅猛。潜伏期一般为5-15d，最高死亡率可达100%。这类病毒能引起鳖、龟、牛蛙、蟾蜍、日本鳗鲡、鲈鱼、牙鲆、真鲷、鲶鱼、大菱鲆、石斑鱼和鲍鱼等近百种水生动物发病，危害极大[2,7,19]。被感染的病鱼一般体色发黑，鳃部呈贫血状态，体表和鳍出血，病鱼肝脏、脾脏、头肾等处增生肿大。如果拿脾脏组织切片进行观察，能发现异常肥大的细胞，这些细胞中含有大量的病毒粒子。2.2免疫原性虹彩病毒大多数病毒株的毒力很强，但免疫原性很低。虽然动物在感染后7-21d内能够产生补体结合性抗体、沉淀抗体和红细胞吸附抑制抗体，但不管是自然感染还是人工感染，都很难发现中和抗体的存在。不过感染过虹彩病毒的水生生物，常能抵抗同类型毒株的攻击。研究表明，曾感染过虹彩病毒的水生生物对再感染的抵抗力增强，可能是由于体内产生了一种干扰素样物质的缘故[17]。由于虹彩病毒变异程度高，疫苗接种的效果一般都不是很理想。近期日本和我国的部分地区应用弱毒疫苗进行预防注射。虽然接种疫苗能产生高价抗体，但并没出现良好的免疫保护力。因此，关于虹彩病毒的疫苗研制，目前尚不十分成功。特别是弱毒疫苗的大量使用，在一定程度上导致出现了许多健康携毒个体[18,19]。3虹彩病毒的功能基因组学已知的虹彩病毒(包括以昆虫为宿主)有近百种，目前已测定出9种虹彩病毒的全基因组序列。它们分别为最早测出全基因组序列的淋巴囊肿病毒Ⅰ型(Lymphocystisdiseasevirus-1,LCDV-1)，从鳜鱼和虎纹蛙中分离到的两个虹彩病毒株ISKNV和TFV[7,25]。从新加坡石斑鱼中分离得到了一种虹彩病毒株SGIV，从台湾石斑鱼中分离到的虹彩病毒株（GIV），从中国大陆石斑鱼中分离到的虹彩病毒(orange-spottedgrouperiridovirus,OSGIV),淋巴囊肿病毒中国株(Lymphocystisdiseasevirus-China,LCDV-C),Rockbreamiridovirus(RBIV),Ambystomatigrinumvirus(ATV)和Chiloiridescentvirus(CIV)。虹彩病毒的功能基因组学研究多集中在以下几个方面。1）病毒的结构蛋白和基因组多态性分析；2）病毒单个功能基因的研究，如主要衣壳蛋白（Majorcapsidprotein,MCP）基因、胞嘧啶甲基转移酶基因，核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotidereductase)，真核起始因子2(eukaryoticinitiationfactor2,eIF-2)，延迟早期基因p31基因，DNA聚合酶和腺苷三磷酸酶(ATPase)等；3）病毒的转录与表达。4虹彩病毒的感染与复制这方面的研究主要集中在蛙病毒属模式种FV3。FV3在感染细胞的初期与表面细胞受体相互作用，通过细胞内吞方式进入宿主细胞内[28]。在宿主细胞核内，病毒粒子利用甲基化的病毒基因组DNA作模板，通过宿主细胞的II型RNA聚合酶（PolII）进行即发行早期（Immediateearly,IE）和迟发行早期（Delayedearly,DE）基因的转录与合成。病毒的早期基因在细胞核内复制、转录并表达出DNA聚合酶，然后通过病毒基因编码的DNA聚合酶开始病毒基因组的复制与合成。FV3病毒DNA聚合酶对一种细胞DNA聚合酶抑制剂Aphidicolin和抗病毒化合物如Phosphonoaceticacid(PAA)敏感。在细胞核内合成的病毒DNA被转运到细胞质，在细胞质内进行第二阶段病毒基因组DNA的复制，最终完成病毒DNA的甲基化和晚期基因的转录合成。像其它的DNA病毒如疱疹病毒一样，虹彩病毒FV3晚期基因的转录与表达需要病毒DNA的合成。[1]。5新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)研究进展[52-56]本实验室利用细胞培养方法，从新加坡养殖石斑鱼中分离出一种致病虹彩病毒，该病毒可导致石斑鱼死亡率达90%以上。经一系列的结构、形态发生、生化和分子生物学研究分析，我们确定该病毒为一种新的虹彩病毒－新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus,SGIV)。石斑鱼虹彩病毒(SGIV)主要存在于宿主细胞质中，为正二十面体，直径大小介于154－176nm，双层膜包围着一个93nm的电子致密核，其核衣壳亚单位约为5nm。细胞外病毒颗粒被囊膜包被，大小为200nm。在电子显微镜下，观察到了病毒粒子在细胞内发生和复制的各个阶段。我们还在世界上首次发现了虹彩病毒粒子在宿主细胞内的自组装过程，病毒的核酸—蛋白质复合体核物质，首先进入部分形成的开放式核衣壳中，然后开放式核衣壳封闭形成完整的病毒核衣壳（nucleocapsid）。我们用自己研究的新方法提纯SGIV病毒抗原，研制出了一系列新的多克隆和单克隆抗体。利用这些抗体，运用免疫吸附亲和层析、WesternBlot、免疫荧光技术和免疫金标记电子显微镜技术等，研究分析了SGIV的分子抗原特性。SGIV病毒表面抗原主要位于整个病毒粒子的外壳上。当纯化的病毒粒子被1％的TritonX-100轻微作用后，在破坏的包膜区域发现了许多金色粒子。但当外部包膜完全被1%TritonX-100移走后，在核壳体上仅有少量的粒子被看到。这表明，病毒包膜与抗原性存在关联。在清晰的免疫染色背景下，结果显示抗体对病毒有特异性。另外，我们通过Westernblot技术识别了与病毒抗原性相关的蛋白，还通过杂交免疫荧光技术证明了在血清学上，SGIV病毒与虹彩病毒科的Ranavirus病毒属更为接近。在一系列研究中，我们还发现，最早于SGIV感染GP细胞后的4h，即可检测出被病毒感染的细胞中存有病毒抗原。对健康鱼体进行攻毒实验时，最早于SGIV感染石斑鱼后的第3天，即可在被感染的病鱼血液中检测出病毒抗原。免疫斑点分析揭示，兔抗SGIV的IgG可以对SGIV病毒抗原进行敏感性检测。最近我们已完成了对SGIV病毒全基因组序列的测定，已将该基因组序列登记在(登记号为AY521625)，并对SGIV进行了一系列的功能基因组学研究。SGIV基因组全长140,131bp，是双链环状DNA。该病毒基因组共有162个开放阅读框（ORF），在正反链上分别编码41－1268个氨基酸。由推导氨基酸序列的计算机辅助分析发现：其中有77个ORF与病毒基因同源，23个ORF与功能性病毒蛋白有密切关联。在NCBICD-数据库和PROSITE数据库中发现其存在52个天然保守区域或信号，这包含了DNA复制、转录、核酸代谢、细胞信号传导等酶活性的分类。随后，我们利用激光基质辅助飞行质谱（MALDI-TOFMS）法，鉴定出了26个转录后的蛋白。其中有20个新发现的或以前未鉴定的基因已被成功证实，15个正在进一步鉴定中。由于对养殖石斑鱼的遗传背景和基因组信息知之甚少，尚缺乏在基因组水平上研究石斑鱼虹彩病毒和宿主细胞之间的相