搜索
1.2基因工程的基本操作程序学习目标1.简述基因工程的原理。2.掌握基因工程基本操作程序的四个步骤。3.尝试设计某一转基因生物的研制过程。一、基因工程的四大操作步骤_________的获取↓_____________的构建↓将目的基因导入_________↓目的基因的_____与鉴定基因表达载体受体细胞检测目的基因二、目的基因的获取1.目的基因：(1)主要是指___________的基因。(2)一些具有_________的因子。编码蛋白质调控作用2.获取方法：(1)从基因文库中获取。①基因组文库：含有一种生物_____的基因。②部分基因文库：含有一种生物的_______基因，如cDNA文库。(2)利用PCR技术扩增目的基因。①含义：是一项在生物体外________________的核酸合成技术。②原理：____________。③条件：_____、DNA模板、______、四种脱氧核苷酸。所有一部分复制特定DNA片段DNA双链复制引物Taq酶④过程。a.目的基因DNA受热_____后解链为单链(90～95℃)。b._____与单链相应互补序列结合(55～60℃)。c.在__________作用下进行_____(70～75℃)。d.重复循环多次。⑤结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成_____形式扩增(约为2n)。(3)人工合成法。①条件：基因比较小，___________已知。②方法：通过__________用化学方法直接人工合成。变性引物DNA聚合酶延伸指数核苷酸序列DNA合成仪三、基因表达载体的构建——核心1.构建基因表达载体的目的：(1)使目的基因在_________中稳定存在，并且可以_____给下一代。(2)使目的基因能够_____和_________。受体细胞遗传表达发挥作用2.基因表达载体的组成：3.基因表达载体的功能：通过基因表达载体将_________导入受体细胞。启动子终止子标记目的基因四、将目的基因导入受体细胞1.转化含义：_________进入受体细胞内，并且在受体细胞内_________和_____的过程。2.转化方法：(1)导入植物细胞。①最常用方法。_____________：双子叶植物或_____植物。②其他方法。a.基因枪法：___________。b.花粉管通道法。目的基因维持稳定表达农杆菌转化法裸子单子叶植物(2)导入动物细胞。①常用方法：_________技术。②常用受体细胞：_______。(3)导入微生物细胞。①方法。a.用____处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为___________)。b.感受态细胞吸收____________________。②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、_________________等。显微注射受精卵Ca2+感受态细胞重组表达载体DNA分子遗传物质相对较少五、目的基因的检测与鉴定1.分子水平检测：检测目标与其采用的检测方法(连线)2.个体生物学水平鉴定：接种法、产物功能活性比较法。【微点拨】1.为什么说并不是所有目的基因都可以从基因文库中获得？提示：自然界中不存在、需人工合成的目的基因，不能从基因文库中获得。2.PCR技术中，为什么模板DNA中A与T碱基对比例越高，解链温度相对越低？提示：DNA分子中A与T之间有2个氢键，G与C之间有3个氢键，所以模板DNA中A与T碱基对越多，形成的氢键相对越少，解链需要的温度相对越低。3.基因表达载体中标记基因的作用是什么？提示：鉴别、筛选含有目的基因的受体细胞。4.将目的基因导入受体细胞的步骤中，导入的是基因表达载体而不是单独的目的基因，为什么？提示：单独的目的基因不能在受体细胞内稳定存在和表达，也不能遗传给下一代。5.基因工程的四个步骤中，都涉及碱基互补配对吗？为什么？提示：不是。“将目的基因导入受体细胞”不涉及，其他3个步骤都涉及碱基互补配对。1.下列对目的基因获取的理解，不正确的是()A.目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B.目的基因主要指编码蛋白质的基因C.基因文库就是基因组文库D.cDNA文库只含有某种生物的一部分基因【解析】选C。目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以人工合成。目的基因主要指编码蛋白质的基因。基因文库分为基因组文库和部分基因文库，cDNA文库是部分基因文库。2.在基因工程技术中，需要用到CaCl2处理的环节是()A.目的基因的提取和导入B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测与表达【解析】选C。将目的基因导入原核生物受体细胞时，首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后在一定条件下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。3.在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要()①DNA连接酶②同一种限制酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥4种脱氧核苷酸A.③⑥B.②④C.①⑤D.①②④【解析】选A。在基因工程的操作过程中，需要用同一种限制酶切割目的基因与载体，并用DNA连接酶将两者的黏性末端(或平末端)连接起来，所选择的质粒必须具有标记基因，以便进行目的基因的检测。4.下列有关基因表达载体的构建的说法不正确的是()A.基因表达载体的构建是实施基因工程的核心B.构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给下一代，同时使其能够表达和发挥作用C.启动子存在于基因的编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动转录D.标记基因的作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因【解析】选C。基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心；构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用；启动子存在于基因的非编码区，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录，最终翻译出蛋白质；载体上的标记基因的作用是鉴定受体细胞中是否含有目的基因。所以只有C项是错误的。5.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是()A.DNA分子杂交技术B.荧光分子标记技术C.放射性同位素标记技术D.显微注射技术【解析】选A。检测目的基因常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等进行标记，以此作为探针，并使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。6.以下有关基因工程的叙述，正确的是()A.利用PCR技术可以大量扩增目的基因B.目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法C.用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端D.利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达【解析】选A。PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法；用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端，便于两者连接；利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞，但不能确定目的基因是否得以表达。一、获取目的基因及基因表达载体的构建1.cDNA文库与基因组文库的主要区别：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以2.获取目的基因的方法比较：(1)过程比较。①基因组文库：供体生物全部DNADNA片段受体菌群目的基因②cDNA文库：供体生物mRNAcDNA受体菌群目的基因③PCR技术：目的基因单链DNA双链DNA大量目的基因④人工合成：蛋白质的氨基酸序列目的基因DNA核苷酸序列mRNA核苷酸序列(2)四种方法的比较：方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)优点操作简单专一性可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度，技术要求高适用范围小3.基因表达载体的构建：(1)组成位置：基因的首端功能：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA位置：基因的尾端功能：终止转录目的基因启动子终止子标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因(2)构建方法：【易错提醒】启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。1.(2012·浙江高考)天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是()A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制酶从开蓝色花的矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞【解题关键】明确获取目的基因的方法、基因工程的工具及基因工程操作的基本步骤。【解析】选A。由题意知：控制蓝色色素合成的基因B是目的基因，提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经反转录获得互补的DNA，再扩增基因B，然后导入天然的玫瑰细胞中，经培育该受体细胞即能获得蓝玫瑰，故选项A正确。限制酶用于切割目的基因而不是获取目的基因；将目的基因B与质粒连接需用DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；基因B需与质粒连接形成基因表达载体再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，而不能将基因B直接导入大肠杆菌。2.(2014·聊城高二检测)下列关于基因表达载体的构建描述错误的是()A.基因表达载体的构建是基因工程的核心B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分C.目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因D.构建的基因表达载体都是相同的【解题关键】解答本题需要明确以下两点：(1)基因表达载体的组成；(2)构建基因表达载体的目的、方法。【解析】选D。基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成，除目的基因外，还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；由于受体细胞不同，基因表达载体也会有差别，不可能都是相同的。【变式备选】下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术合成⑤利用DNA转录形成⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥【解析】选D。目的基因的获取可以从基因文库中提取，也可以用mRNA反转录形成DNA的一条链，然后合成DNA分子；对于一些已知一段核苷酸序列的目的基因，可用PCR技术扩增合成；对于一些短小而无模板且已知核苷酸序列的目的基因可用人工合成法。受体细胞是目的基因表达的场所，不能从中提取目的基因；DNA转录出的是RNA，不能得到目的基因。二、目的基因导入受体细胞及检测与鉴定1.目的基因导入受体细胞的常用方法：受体细胞种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体的DNA上→表达目的基因表达载体的提纯→取卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→感受态细胞，表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子2.农杆菌转化法分析：(1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(2)重组的基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是用Ca2+处理。(3)目的基因能够在受体细胞内稳定维持和表达的关键是目的基因插入受体细胞染色体DNA上。(4