麻风树生物柴油研究和开发进展

麻风树生物柴油研究和开发进展陈　放　徐　莺　唐　琳　王胜华　吴　军（四川大学生命科学学院，四川大学生物能源研究所，四川大学国际麻风树研究中心，成都，610064）dio:10.3969/j.issn.1674-0319.2009.05.004随着世界能源消耗量的不断剧增，生态环境恶化加剧，能源安全与环境问题正在越来越深刻地影响着当今全球社会和经济的可持续发展。寻求发展生物能源等可再生能源或新能源来解决目前和未来的能源与环境问题已成为国际上备受关注的热点，不少国家正在或已制定有关生物能源的发展战略。当前正在持续的国际金融危机对新能源产业的发展带来新的挑战与新的机遇。作为能源消耗大国的中国也正面临日趋严峻的能源与环境问题。近年来，我国政府高度重视可再生能源与新能源的发展，已将其确定为国家产业发展的重点方向，大力发展生物能源是符合国情的战略选择。麻风树（Jatropha.curcasL.），又名小桐子，主要分布于热带和亚热带地区，主要生长在美洲和亚洲热带地区。在我国栽培或半野生于南方热带和亚热带地区，分布面积较广、资源较丰富（参见图1、图2）。近年来发现该种植物在工业用油、生物化工、生物农药、新药开发等方面有着潜在价值，麻风树是目前公认的最适宜开发的生物柴油树种，并且又是干热河谷等地区造林绿化的优良树种，因此具有广泛的利用前景。麻风树的生态分布广泛，从干热的亚热带到潮湿的热带雨林都有其分布，它可以在年降雨量200～1200mm、年平均气温18～28.5℃的环境下生存。麻风树常生于海拔500~1600m的平地、丘陵坡地及河谷荒山坡地，常栽培于园边作绿篱，也有一些为半野生状态。麻风树喜光、喜暖热气候，耐干旱瘠薄，已在不少国家栽培。本文主要介绍有关四川大学麻风树生物柴油研究与开发的进展情况。1　麻风树种质资源研究和优良麻风树类型选育开展对现有麻风树资源的筛选、评价研究，是培育麻风树生物柴油专用品种必不可缺的工作，也是较快获得具有栽培价值的优良麻风树类型的方法。在从印度尼西亚、缅甸、柬埔寨、印度、马来西亚、巴西、马达加斯加、马里等作者简介陈放，四川大学生命科学学院院长，教授、博士生导师，生物能源研究所所长；中国可再生能源学会理事及生物质能专委会副主任，中国植物学会常务理事；主要从事能源植物及生物技术的研究与开发。近几年来共主持承担了国家自然科学基金、国家科技支撑计划等国家及部省重大重点科研课题与国际合作项目10余项，主要涉及麻风树等能源植物资源评价与育种技术、分子生物学、基因技术及生物柴油与综合利用的关键技术研发等领域。图1　四川野生麻风树种质资源图2　大规模种植的麻风树①参考文献YangHe,XiulianGuo,RanLu,etal.ChangesinmorphologyandbiochemicalindicesinbrowningcallusderivedfromJatrophacurcashypocotyls.PlantCellTissOrganCult,2009,98:11-17.②参考文献XiaoboQin,XiaojiangZheng,CaixiaShao,etal.Stress-inducedcurcin-LpromoterinleavesofJatrophacurcasL.andcharacterizationintransgenictobacco.Planta,2009,10.1007/s00425-009-0956-9.③参考文献GaoS,ChenF.Effectsofsaltstressongrowth,antioxidantenzymeandphenylalanineammonia-lyaseactivitiesinJatrophacurcasL.seedlings.PlantSoilEnviron,2008(9):374-381.④参考文献YangHe,VijayaPasapula,XiangLi,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofjatrophacurcas:factorsaffectingtransienttransformationefficiencyandmorphologyanalysisoftransgeniccalli.SilvaeGenetica2009,58(3):123-128.SPECIALFEATURE54生物产业技术2009.05(9月).专题报道麻风树生物柴油研究和开发进展国家和我国四川、云南、广西、广东、海南等地区收集上千份麻风树材料的基础上，研究人员着重对其种子含油量和植株抗逆性等方面进行了研究。对麻风树种子及种子油性质的相关数据进行方差分析，结果表明，产地不同，麻风树种子的生物学性质、种子油理化性质和脂肪酸组成都存在一些差异。以我国西南6个地区采集的麻风树种子为例，所有样品的百粒重范围为41.80～71.39g，出仁率为60.02%～81.43%，种仁含油率为51.76%～57.93%，种子含油率为31.07%～47.17%，不饱和脂肪酸含量为74.89%～79.68%。在种子含油量方面，以云南永胜产麻风树的种子最高，其出仁率为81.43%，种仁含油率为57.93%，种子含油率为47.17%，不饱和脂肪酸含量为79.68%。攀枝花和宁南产麻风树的种子次之。在酸值方面，云南双柏和贵州罗甸麻风树的种子油酸值为0.81，在所有样品（0.81～9.46）中最低。笔者研究团队与公司合作首次开发了麻风树种子含油量快速微量无损伤检测方法及设备。在进行麻风树种子含油量和水分测定时，可利用低场核磁共振分析仪进行麻风树种子含油量的快速微量测定，方法简单、结果可靠、对种子无损伤，检测出的高含油量种子可直接用于育种试验。在耐低温种质资源的筛选过程中发现，三个不同产地（四川攀枝花、云南红河和永胜）的麻风树用8℃的低温胁迫处理后，所受到的伤害（叶绿素含量减少、根系活力降低、生物膜通透性增大等指标）以云南永胜的最低，四川攀枝花的次之，云南红河的最高，并且这种影响与资源所在地的气温呈负相关关系，这提示在年均气温较低地区可能容易发现耐寒性强的优良单株。为了确定上述变异与环境和遗传图3　四川大学选育的麻风树生物柴油专用新品种⑤参考文献王云霄,张颖,江璐玎等.麻风树水通道蛋白新基因JcPIP干旱胁迫下的功能分析.热带亚热带植物学报，2008,16(4):289-295.⑥参考文献罗孟军,陈放,颜钫等.麻风树核糖体失活蛋白curcin在大肠杆菌中高效表达条件的研究.中国中药杂志，2009，34(6):656-659.⑦参考文献秦小波.麻疯树两种核糖体失活蛋白的表达模式分析.植物生理学通讯，2008,44(5):891-896.⑧参考文献毛俊娟，倪婷,王胜华等.干旱胁迫下外源钙对麻风树相关生理指标的影响.四川大学学报(自然科学版),2008,45(3):669-673⑨参考文献张正银，刘波洋，陈放等.麻风树AFLP体系的建立与优化.应用与环境生物学报，2009，15(2):280-283.⑩参考文献张富丽，蔡峰，吴军等.转麻风树甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草耐盐性.中国农业科学，2008,41(12):4030-4038.55生物产业技术2009.05(9月).因素之间的关系，进一步开展分子标记研究是非常必要的。从麻风树9个自然居群135个样品的ISSR分子标记研究结果来看，自然界的麻风树具有丰富的遗传多样性水平（多态百分率PPB=97.04%，Nei’s遗传多样性H=0.2357，Shannon信息指数I=0.3760），特别是群间遗传多样性较大（Gst=0.5398），高于居群内数据。后者水平较低可能与麻风树扦插、近交占主导的繁育方式有关。现已初步筛选出含油量高或抗逆性强的优良单株130余株，其中种仁含油量超过65%且生长快速的有120余株，耐寒单株7株，抗虫单株5株。建立了高产优质麻风树实生苗和扦插苗种植技术和高含油麻风树品种选育技术，规模化育苗可达30000株/亩；在规范化人工栽培的条件下，每亩可产麻风树种子300～500kg，可加工生物柴油140～180kg；通过单株系统选育，筛选出了高含油率的麻风树新品种CSC63#，其种仁平均含油量达63%，已获得四川省品种认定证书（川R-SC-JC-002-2005）。2　现代生物技术在麻风树生物柴油专用品种培育中的应用将现代生物技术应用于麻风树优良品种（参见图3）的培育，是目前研究的重点方向，主要包括组织培养技术和分子育种技术两方面。以麻风树花药和胚乳为外植体诱导愈伤组织并进一步分化成植株已经取得成功，可以缩短麻风树育种周期，可用于耐寒、耐盐碱等麻风树品种的培育。分子标记的结果提示基因遗传因素在麻风树相关性状的决定中具有重要作用，因此了解相关过程的分子基础，发现其中的关键控制基因，对于利用现代育种技术培育麻风树优良品种具有重要的意义，笔者研究团队着重开展了以下工作：①麻风树胚乳cDNA文库的建立及规模测序工作；②克隆鉴定参与麻风树油脂合成代谢的基因；③克隆鉴定参与麻风树逆境应答的基因；④克隆参与麻风树性别分化与花发育的基因。现已克隆和鉴定了多个与麻风树油脂合成及抗逆性等相关的基因，如麻风树叶绿体w3脂肪酸脱饱和酶基因、麻风树甜菜碱醛脱氢酶基因（JcBD1）、麻风树干旱胁迫相关的水通道蛋白基因（JcPIP2）、麻风树干旱诱导差异表达基因（JcMIPS）、麻风树硬脂酰-酰基载体蛋白脱饱和酶基因、麻风树雌性相关基因（JCFD003）、麻风树毒蛋白（curcin）基因等，为利用基因工程技术筛选和培育麻风树优良品种奠定了基础。3　良种快繁技术当前的麻风树生产中，主要利用实生苗进行繁殖。研究显示，即使这些实生苗来自于同一母株，子代植株之间、子代与母株之间含油率仍有显著差异；与之相反，扦插苗较好地保持了母株的含油率。这一结果表明，就含油量可控性方面来说，无性繁殖方式优于实生苗繁殖，从而建立了高效低成本的麻风树无性快繁技术体系。在利用麻风树腋芽进行繁殖时发现，KT（激动素）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）的激素搭配适于诱导愈伤组织，促进腋芽增殖需要在培养基MS+1.0mg/LBA+0.01mg/LIBA+5.0mg/LAgNO3上进行，pH值的变化对腋芽分枝的影响不大，SPECIALFEATURE参考文献郭亮，卿人韦，何玮等.麻风树叶绿体w3脂肪酸脱饱和酶基因的克隆和鉴定.应用与环境生物学报，2008，14(4):469-474.参考文献罗绍银，高继海，叶生亮等.一种提取富含油脂植物组织总RNA的改良SDS酸酚法.应用与环境生物学报，2009，15(2):284-287.参考文献林莎，罗绍银，林颖等.从麻风树胚乳中提取总RNA的快速方法.应用与环境生物学报，2008，14(5):692-694.参考文献刁明苏，徐莺,陈放.麻风树毒蛋白对小鼠器官的急性毒性研究.四川大学学报(自然科学版),2008,45(4):967-971.参考文献林莎,高帆,罗洪等.麻风树JcTctpl基因的同源性分析及时空表达模式鉴定.中国生物化学与分子生物学报,2008,24(8):727-734.参考文献卢静惠,吴军,肖科等.麻疯树花的形态结构与传粉关系研究.四川大学学报(自然科学版)，2008,45(4):1485-1488.参考文献江璐玎，王云霄，王迎春等.麻风树酰基载体蛋白的基因克隆、表达分析及原核表达.应用与环境生物学报，2008，14(6):769-773.参考文献淳俊,郑彦峰,王胜华等.一种广泛适用的RNA提取方法.生物化学与生物物理进展，2008,35(5):591-597.参考文献吴军，王胜华，陈放.麻风树油脂含量遗传性与CSC高油63品种的选育.种子,2008,27(5):100-102.参考文献RYan,SGao,WYang,etal.Nickeltoxicityinducedantioxidantenzymean