黄瓜耐低温基因转化后代的生物学鉴定

中国蔬菜2010（10）：16-19CHINAVEGETABLES黄瓜耐低温基因转化后代的生物学鉴定卢淑雯1刘文萍1李柱刚1南相日1刘建新1秦智伟2（1黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨150086，2东北农业大学，黑龙江哈尔滨150030）摘要：对耐低温基因BnCS转化黄瓜植株T0种子及T1植株进行生物学鉴定，结果表明，经低温胁迫，黄瓜品系yd-36的转基因植株T0种子13℃的发芽势、发芽率及胚根长均显著高于非转基因种子；T1植株的电解质渗漏率和丙二醛含量也显著低于非转基因植株，株高、茎粗和叶面积的生长量均高于非转基因植株。证明转基因植株耐低温能力明显强于非转基因植株。关键词：黄瓜；耐低温基因；转化后代；生物学鉴定中图分类号：S642.2文献标识码：A文章编号：1000-6346（2010）10-0016-04BiologicalIdentificationofLowTemperatureToleranceGeneTransformofCucumberandItsProgenyLUShu-wen1,LIUWen-ping1,LIZhu-gang1,NANXiang-ri1,LIUJian-xin1,QINZhi-wei2（1HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,Heilongjiang,China;2NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,Heilongjiang,China）Abstract：LowtemperaturetolerancegeneBnCSwastransformedintocucumber（CucumissativusL.）plants.Biologicalcharacteristicsoftransgenicplant（T0）anditsprogeny（T1）werebiologicallyidentified.Underlowtemperaturestressat13℃,thegerminationpotential,germinationpercentageandradiclelengthoftransgenicT0seedweresignificantlyhigherthantheCK（cultivaryd-36）.ThepercentageofelectrolyteleakageandMDAcontent（T1）weresignificantlylowerthantheCK.Whiletheincrementgrowthofplantheight,stemwidthandleafareawerehigherthantheCK.Thisindicatedthatlowtemperaturetoleranceoftransgenicplantswasobviouslyhigherthanthatofthenon-transgenicplants.Keywords：Cucumber;Lowtemperaturetolerancegene;Transformedprogeny;Biologicalidentification黄瓜（CucumissativusL.）是我国重要的喜温果菜之一，冬、春季保护地及早春露地栽培时经常出现低温冷害，对早熟丰产影响极大，严重影响黄瓜生产。随着转基因技术的广泛应用，黄瓜耐低温基因转化研究报道较多，但对转化后代耐低温性鉴定却鲜有报道。本试验对转基因植株及其后代进行耐低温典型性状测定，进一步证明耐低温基因BnCS的功能及其在后代中的遗传表现。1材料与方法1.1试验材料转化载体为黄瓜品系yd-36，由黑龙江省农业科学院园艺分院黄瓜育种室提供。从获得的转收稿日期：2009-12-21；接受日期：2010-03-15基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目（C200611）作者简介：卢淑雯，研究员，博士，主要从事蔬菜育种研究，E-mail：[e-mail]2010（10）卢淑雯等：黄瓜耐低温基因转化后代的生物学鉴定17化植株中选取5个株系，以T0种子和T1植株作试材，以非转基因种子和植株作对照。BnCS基因和质粒pBI121-BnCS由黑龙江省农业科学院生物技术研究所克隆和构建，质粒携带卡那霉素（Kan）抗性筛选标记，农杆菌为EHA105，具有利福平（Rfp）和链霉素（Str）抗性。1.2试验方法本试验于2008～2009年在黑龙江省农业科学院生物技术研究所黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室进行。1.2.1耐低温基因BnCS对黄瓜的遗传转化和分子鉴定培养黄瓜无菌苗，切取培养3～4d的子叶节，进行1d的预培养。用刀片在子叶节的表面轻划，制造微伤口，然后将子叶节置于制备并悬浮好的农杆菌菌液中，侵染20min。用滤纸吸去子叶节上的多余菌液，转接到MS+1.0mg·L-16-BA、pH5.2的共培养培养基上，26℃暗培养3d。取出用无菌水冲洗2次，然后用脱菌抗生素cef（注射用头孢噻肟钠1000mg·L-1）水溶液清洗3次，吹干，转接到MS+1.0mg·L-16-BA、50mg·L-1Kan、500mg·L-1cef的选择培养基上。每7d继代培养1次，有丛生芽发生后，将其切下，转入1/2MS生根培养基，生根后移栽。在生根培养的同时对幼苗进行PCR鉴定和Southern检测，经Southern检测阳性的黄瓜植株，定植于温室中，正常管理，自花授粉，成熟后收获T0种子，T0种子播种，获得T1植株。1.2.2转基因植株T0种子低温发芽力的鉴定选择饱满、色泽正常的T0种子及对照非转基因种子60粒，分成3份，每份20粒。55℃温汤浸种10min，洗净后播于垫有滤纸的培养皿中，放入HPG-280型光照培养箱，在黑暗条件下发芽。温度设定为13、15、28℃，以胚根露出种皮为标准，逐日统计发芽粒数。发芽第5天统计发芽势，发芽末期（第9天）统计发芽率，测定胚根长度。计算不同温度下T0种子和非转基因种子的平均发芽势、发芽率以及胚根长度。1.2.3转基因植株T1苗期耐低温能力鉴定和形态学调查转基因植株T0种子和对照非转基因种子，经浸种、28℃催芽于次日播种于营养钵内，7d后子叶完全展开，真叶刚刚露出时开始处理。白天（23±1）℃9～10h，夜间放入10℃培养箱中低温处理14～15h，处理15d后，测定电解质渗漏率和丙二醛（MDA）含量，同时测定株高、茎粗、叶面积。2结果与分析2.1黄瓜转基因植株的获得及分子鉴定黄瓜子叶节经农杆菌侵染后在选择培养基上培养，14～21d后部分子叶节基部长出抗性芽，而大部分子叶节未分化芽或长白芽。将绿色抗性芽转移到1/2MS培养基上，抗性芽逐渐伸长，大约14d后有根生成，发育成完整植株。取再生植株的叶片进行PCR鉴定，检测159株，其中61株经特异性引物扩增出BnCS片段，该片段大小与质粒DNA片段大小一致，其阳性检出率38.4%，对照非转基因植株未扩增出BnCS片段。对32株PCR阳性植株进行杂交检测，Southern阳性率18.7%。2.2转基因植株T0种子低温发芽能力鉴定基因型在很大程度上决定着种子发芽过程的耐低温性。有文献报道（Haskell&Singleton，1994；Jennings&Saltveit，1994；Abdur&Milcal，1996），不同基因型在低温条件下的发芽能力差异显著。许勇和王永健（1995）研究表明，黄瓜低温发芽能力与苗期低温耐受性鉴定指标的相关性达到了极显著水平。这些结果为黄瓜耐低温性早期鉴定提供了理论依据。本试验在低温和常温条件下，对转基因植株T0种子和对照非转基因种子的发芽势、发芽率、胚根长进行测定，结果显示（表1），转基因植株T0种子的低温发芽能力明显增强。在28℃正常温度下，T0种子的发芽势、发芽率及胚根长都低于对照；但在13℃下，T0种子的发芽势、发芽18中国蔬菜CHINAVEGETABLES2010年5月（下）率和胚根长均明显高于对照，其中发芽势比对照高150%，胚根长比对照高47.1%，发芽率与对照接近。说明BnCS基因已整合到黄瓜基因组中，而且低温诱导下在各器官中得到表达，表现出较强的低温耐受性。表1不同低温处理后T0种子的发芽势、发芽率及胚根长发芽势/%发芽率/%胚根长/cm种子28℃15℃13℃28℃15℃13℃28℃15℃13℃T0种子93.423.450.093.490.090.02.611.311.78非转基因种子（CK）100.036.020.0100.0100.078.02.851.961.212.3转基因植株T1苗期电解质渗漏率的测定质膜相变引起的电解质外渗是低温伤害的一个重要方面。电解质渗漏率则反映了特定低温下质膜的透性。电解质渗漏率是一个对低温比较敏感的指标，用相对电导率表示，简便易测，为大多数研究者所使用（逯明辉等，2004）。本试验测定低温处理15d后不同株系T1苗期相对电导率，结果表明（表2），转基因株系的相对电导率均低于对照非转基因株系；除株系19-23-2与对照差异不显著外，其他4个株系均极显著低于对照。说明转基因植株中BnCS基因的表达，使细胞膜中形成耐低温跨膜结构域，从而减轻低温伤害，使之对低温的耐受能力明显高于非转基因植株。2.4转基因植株T1苗期MDA含量的测定植物组织在逆境下遭受伤害，发生膜脂过氧化反应。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量多少，能够反映膜质过氧化程度，也可间接反映植物组织抗氧化能力的强弱，其含量越高，说明植物遭受逆境伤害的程度越严重（孙艳等，1997）。通过比较低温胁迫下，非转基因植株与转基因不同株系间MDA含量的变化表明（表3），不同株系T1苗期低温胁迫下MDA含量不同，对照最高，除株系19-23-1外，其他4个株系MDA含量均极显著低于对照，说明它们遭受低温逆境伤害的程度不同，对照遭受低温的伤害明显重于转基因株系，证明转入BnCS基因提高了黄瓜转化后代对低温的耐受性。2.5转基因植株T1苗期形态学调查经白天（23±1）℃9～10h，夜间10℃14～15h处理15d后测定转基因植株T1和非转基因植株的株高、茎粗、叶面积（第2片真叶）。由表4可知，低温胁迫严重阻碍所有植株的正常生长，其中非转基因植株生长量最低，5个转基因株系的植株生长量均不同程度高于非转基因植株，其中株系表2不同株系低温处理后相对电导率株系相对电导率/%19-21-1（T1）15.57±0.95eE19-23-1（T1）19.20±0.53dD19-23-2（T1）27.10±1.04abAB19-27-1（T1）25.63±0.83bBC19-27-2（T1）22.57±1.06cCD非转基因植株（CK）30.47±0.85aA注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著（α=0.05），不同大写字母表示差异极显著（α=0.01）；下表同。表3不同株系低温处理后MDA含量株系MDA/nmol·g-1（FW）19-21-1（T1）12.83±0.90bBC19-23-1（T1）13.93±0.15abAB19-23-2（T1）11.80±0.42bcBC19-27-1（T1）9.50±0.36cCD19-27-2（T1）6.13±1.22dD非转基因植株（CK）16.73±1.70aA表4不同株系植株生长量株系株高/cm茎粗/cm叶面积/cm219-21-1（T1）0.520.113.7219-23-1（T1）0.310.083.2719-23-2（T1）0.470.093.4619-27-1（T1）0.510.104.0019-27-2（T1）0.550.124.13非转基因植株（CK）0.360.093.122010（10）卢淑雯等：黄瓜耐低温基因转化后代的生物学鉴定1919-27-2的生长量最高，耐低温性表现最优。3结论与讨论本试验中低温胁迫温度为白天23℃、夜间10℃，是基于黄瓜保护地生产中经常发生的低温冷害而设计的。根据当前的生产实