（第四版）中国医科大学生物化学与分子生物学教研室

（第四版）中国医科大学生物化学与分子生物学教研室2002002002008888年04040404月生物化学实验（第四版）主编：魏金荣副主编：关一夫，于爱鸣党员编者（按姓氏笔画顺序）：毕强李雪松刘素媛邢伟武迪迪郑华川宗志红宿文辉阎敬韩晓曦魏金荣非党员编者（按姓氏笔画顺序）：王彪孙黎光安丽文冯晨张天彪郝凤进赵国杰袁莹中国医科大学生物化学与分子生物学教研室2008年4月前言近十年来，科学技术的迅猛发展，使得生物化学与分子生物学的实验技术和方法层出不穷、日新月异。虽然我们对生物化学与分子生物学实验课教学内容陆续进行过一些调整和改革，但仍显得不能适应现代生物科学发展的需要。为此，为了顺应学科的发展，全面提高实验教学水平和质量，使得学生能够学习和掌握现代生物学技术，中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学党支部启动了旨在进行实验课教学改革的党员工程项目。在此次新版实验手册的编写过程中，我们以具有多年实验课教学经验的党员教师为核心，首先通过大量的文献调研，提出初步的改革设想；由教研室主任关一夫教授和教研室副主任于爱鸣教授对改革方案提出修改意见；经全体参编人员的认真论证和反复研究，最后确定了改革方案。新的改革方案对实验课教学内容进行了整体规划。新版的实验手册保留了原有较为先进的部分实验以及具有参考价值的实验，增添了部分先进的分子生物学实验和技术较新的实验，如充实和完善了综合性实验“1-抗胰蛋白酶的分离纯化”，增添了“免疫印迹”、“RNA的制备与分析”、“DNA酶解和DNA片段琼脂糖凝胶电泳”和“PCR”等先进的分子生物学实验和体现生物化学特点的“底物浓度对酶活性的影响－Km值的测定”和“抑制剂对酶活性的影响”的基本实验。为了保证实验的可行性和准确性，我们对某些实验进行了预实验。在新版实验手册的编写过程中，党员教师承担了新内容的编写和修改的繁重工作，同时部分党外的青年骨干教师积极参与该项活动，承担了部分文字录入工作。在此对关一夫教授、于爱鸣教授的大力支持及部分党外教师的大力帮助表示感谢。本实验手册难免有不妥之处，希望广大师生提出宝贵意见。编者2008年4月10日目录第一部分常用生物化学实验技术及原理一、常用生物材料的处理……………………………………………………………………1二、比色分析法和分光光度法………………………………………………………………4（一）比色分析法的基本原理………………………………………………………………4（二）比色分析的测定方法··………………………………………………………………7（三）常用分光光度计的使用……………………………………………………………10三、电泳技术………………………………………………………………………………12（一）基本原理……………………………………………………………………………12（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳………………………………………………………………16（三）等电聚焦电泳………………………………………………………………………22四、层析法…………………………………………………………………………………26（一）层析技术的发展简史及科学意义…………………………………………………26（二）层析技术的基本原理………………………………………………………………27（三）层析法分类…………………………………………………………………………28（四）凝胶过滤层析………………………………………………………………………29（五）离子交换层析………………………………………………………………………32（六）亲和层析……………………………………………………………………………35第二部分实验一、蛋白质的测定··………………………………………………………………………38实验一微量凯氏（Kjeldahl）定氮法·……………………………………………38实验二Folin—酚试剂法（Lowry法）·…………………………………………40实验三双缩脲法（Biuret法）··…………………………………………………42实验四考马斯亮兰法（Bradford法）··…………………………………………43实验五紫外吸收法………………………………………………………………44实验六BCA法……………………………………………………………………45二、酶促反应动力学……………………………………………………………………46实验七酶的特异性、激动剂及抑制剂…………………………………………46实验八pH对酶活性的影响………………………………………………………47实验九底物浓度对酶活性的影响·………………………………………………50实验十抑制剂对酶活性的影响·…………………………………………………52实验十一温度对酶促反应速度的影响·…………………………………………54实验十二酚标准曲线的绘制·……………………………………………………55实验十三尿淀粉酶活性测定（温氏法）·………………………………………55三、生物氧化·……………………………………………………………………………57实验十四乳酸脱氢酶及辅酶Ⅰ·…………………………………………………57实验十五琥珀酸脱氢酶·…………………………………………………………59实验十六细胞色素氧化酶实验·…………………………………………………59四、糖代谢·………………………………………………………………………………60实验十七运动对尿中乳酸含量的影响·…………………………………………60实验十八血糖定量（邻甲苯胺硼酸法）·………………………………………62实验十九肝糖原实验·……………………………………………………………64实验二十尿糖定性（班氏法）··…………………………………………………65五、脂类…………………………………………………………………………………66实验二十一肝脂类的提取及薄层层析…………………………………………66实验二十二血清总胆固醇定量…………………………………………………67实验二十三尿中酮体定性Lange法……………………………………………69六、蛋白代谢……………………………………………………………………………69实验二十四血清蛋白的醋酸纤维素膜电泳分离及测定………………………69实验二十五血清尿素氮定量（二乙酰一肟法）………………………………72实验二十六牛血清抗胰蛋白酶（α1-AT）的分离及鉴定··……………………73（－）盐析法………………………………………………………………………74（二）凝胶过滤法…………………………………………………………………75（三）纤维素离子交换层析………………………………………………………76（四）伴刀豆素球蛋白琼脂糖亲和层析…………………………………………77（五）α1-AT酶活力测定··…………………………………………………………78（六）SDS-聚丙烯酰胺凝胶平板电泳……………………………………………79（七）总结·…………………………………………………………………………82实验二十七免疫印迹·……………………………………………………………82七、核酸·…………………………………………………………………………………84实验二十八RNA的制备与分析…………………………………………………84实验二十九从小鼠肝中提取DNA………………………………………………87实验三十核酸的定量测定（定磷法）·…………………………………………90实验三十一DNA的定量测定（改良二苯胺法）………………………………92实验三十二DNA酶解和DNA片段琼脂糖凝胶电泳·…………………………94实验三十三PCR··………………………………………………………………97八、血液生化·……………………………………………………………………………99实验三十四血清无机磷定量·……………………………………………………99附录一、缓冲液………………………………………………………………………………101（一）一些常用缓冲液的化合物的酸解离常数……………………………………101（二）常用缓冲液的配制方法………………………………………………………102二、层析法常用数据表…………………………………………………………………104（一）葡聚糖凝胶的某些技术数据·………………………………………………104（二）琼脂糖凝胶的技术数据………………………………………………………105（三）各种凝胶所允许最大操作压…………………………………………………105三、硫酸铵饱和度常用表………………………………………………………………106四、离心机转子的转速与相对离心力RCF（g）间的换算关系··……………………108第一部分常用生物化学实验技术及原理一、常用生物材料的处理1111．血液（BloodBloodBloodBlood）（1）采血因饮食及其他生理情况常使血液成分发生变动，所以一般应在早晨空腹或禁食6小时以上安静条件下采血。需用血量较少时，可由耳垂或指尖采毛细血管血。采血前先用手揉搓局部，使血液循环旺盛，再用70%酒精进行局部消毒，用刺血针或注射针头穿刺（深约2mm），擦去第一滴血，在不加压力下任血液自然流出，然后使血滴入小试管。静脉采血通常选用肘窝的静脉，局部用碘酒及70%酒精消毒，扎止血带，用严密消毒的注射器穿刺采血，然后注入适当的容器中。①所用注射器、针头及盛血容器都必须是十分清洁干燥的。②针头与针管需要连接严密，在采血过程中不应进入小气泡，否则易发生凝血和溶血。③由注射器注出血液时，必须拔掉针头，沿器壁轻轻地注到容器中，不要有气泡，避免强力冲击。（2）分离血清把新采的血于试管或离心管中，倾斜放置，任其自然凝固，然后移放冰箱或室温放置等待析出血清。如急用时，可在已经完全凝固（约需30~45分钟）后，用细的钝尖玻璃棒紧贴管壁把凝块表面周边粘附管壁处轻轻剥开，然后离心2000~3000rpm约10分钟，移取血清放另外小试管中。（3）抗凝全血及血浆的制备采血后立即注入盛有适当的抗凝剂的试管中，轻振使抗凝剂溶解并混匀，即可得到不凝的全血。把抗凝血液离心（2000~3000rpm5~10分钟），使有形成分下沉，上部即为血浆。用乳头吸管注意吸取血浆，移放另外试管中备用。生化实验中常用的抗凝剂有：①草酸盐，用量为2mg/ml。②乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），1mg/ml。③氟化钠，10mg/ml，它还有抑制糖酵解作用。④肝素（Heparin），0.05mg/ml。这些抗凝剂使用固体粉末，也可以预先配成一定浓度的溶液，按计算量（例如5ml血液需要10%草酸钾0.1ml）加入试管中，然后放烘箱中于80℃以下烘干，便于使用。血液加入抗凝剂后，要及时轻轻摇动使抗凝剂溶解并混匀，不可强力振荡，避免溶血。抗凝剂的药量要适当，过少不足以抗凝，过多则影响实验。又根据实验目的不同要对抗凝剂加以选择，如用草酸铵则不适于氮定量。如血糖定量可用氟化钠以防止糖的分解，最好与草酸盐并用（每ml血用草酸盐2mg＋氟化钠3~4mg）。肝素抗凝效果好，适用于各种分析，但价格较贵，一般实验中不必使用。（4）血液样品的保存血液成分容易发生变动，原则上应尽快进行分析。如必需暂时保存时，应放入冰箱。全血最不稳定，可做成除蛋白滤液保存。血浆应及时与血细胞分开，血清也应与凝块分开，单独保存。2222．尿液（UrineUrineUrineUrine）（1）采尿尿液成分及浓度生理变动较大。按实验目的不同，可用不同的尿液。许多定性实验可用随时采取的一次尿样。清晨第一次尿样，比较稳定，便于比较，也常采用。定量实验常需采用全日尿样。全日尿亦即由第一天某时开始到第二天同一时间的24小时尿，具体采法如下：在第一天晨6时排尿一次弃去，以后的排尿全部收集到加有适当防腐剂的容器中，到翌晨6时，不论有无尿意，再主动排尿一次于容器中。采尿中间不可有异物混入。采尿完了后，把全部尿液充分混匀，量记总体积及其他必要项目，然后留取其一部分供实验用。（2）防腐为防止采尿过程中及