TCA-丙酮沉淀法蛋白提取

TCA-丙酮沉淀法蛋白提取仪器：Eppendorf冷冻离心机(Eppendorf)、组织匀浆器、超声破碎仪主要溶液配置：1.10mLSDS裂解液1%DTT，2%SDS，10%甘油，50mMTris-Hcl(pH6.8)。配置：称取0.1gDTT，0.2gSDS，加入1mL甘油和1mL的0.5MTris-Hcl(pH6.8)，然后定容至10mL。2.10mLTriton样品溶解液浓度：150mMNaCl，1％Triton-X-100，50mMTris-HCl(pH8.0)配置：称取0.087gNaCl、加入0.1mLTriton-X-100、500μL浓度为1M的Tris-HCl(pH8.0)加入约9.4mL水，混合溶解均匀。保存：4度保存。3.1mL尿素样品溶解液（现配现用）浓度：9M尿素，4％CHAPS，1%IPGBuffer，1%DTT,配置：称取0.54g尿素、加入0.04gCHAPS、再加入0.56mL双蒸水，溶解后分装-20度冷冻保存，使用前融解后按0.98mL加入0.01gDTT（DTT过早加入会失效）和10μLBuffer的比例混合溶解均匀，最后再加入痕量溴酚蓝。保存：-20度保存。4.RIPA裂解液：浓度：50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，150mmol/LNaCl，0.2g/L叠氮钠，1g/LSDS100mg/LAprotin，10g/LNP-40，5g/L去氧胆酸钠，100mg/LPMSF。(RIPA裂解液有强、中和弱三种类型，其试配置略有差异)配置：称取：0.07882gTris-HCl，0.08775gNaCl，0.002g叠氮钠，0.01gSDS，0.001gAprotin，0.1gNP-40，0.05g去氧胆酸钠，0.001gPMSF。注：以上列举了一些常见的裂解液，除此之外还有多种类型的裂解液，需要研究者根据自己研究的材料和实验目的选择合适的裂解液提取蛋白。蛋白提取及定量：1.取约0.1g样品于离心中，如所取组织较大可先适当剪成小块，加入样品裂解液，加入蛋白酶抑制剂（PMSF或Cocktail）使其终浓度为1mM，。注：如果是植物或者是真菌等具有细胞壁以及不易破碎的物种，需要加入液氮，研磨破碎。培养的细胞或是易破碎的细菌等样品则可以直接加入裂解液。2.将样品置于冰盒上，用组织匀浆器将样品充分打散，如果是研磨后样品，此步可跳过。3.超声破碎，4℃或置于冰盒上，功率80W，超声0.8s，关闭0.8s，共3min，4.4℃，12000g离心10分钟，收集上清，5.加入5倍体积的预冷10%TCA-丙酮震荡混合，-20℃沉淀2小时或过夜，6.4℃，12000g离心10分钟，收集沉淀。7.加入适量体积的预冷丙酮震荡混合，4℃，12000g离心15分钟，收集沉淀，重复该步骤两次次。8.常温下干燥后（一般5分钟左右），溶解于样品裂解液中，30℃恒温水浴溶解1小时，充分溶解蛋白；注：样品不宜过度挥干，易导致蛋白溶解困难9.将溶液在室温下12000g离心10min，取上清，并再次离心取上清，充分去除不容性杂质。10.上清液即为组织的总蛋白溶液，采用Bradford法[MarionM.Bradford.AnalyticalBiochemistry,1976,72:248-254]测定提取的蛋白浓度并分装后储存于-80℃备用或直接用于双向电泳。