基于DNA条形码技术常见肉类掺假鉴别技术的研究

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.8295基于DNA条形码技术常见肉类掺假鉴别技术的研究田晨曦1,2，周巍1,2，王爽2，王赞2，张翠侠2，李永艳2，张岩2，张志胜1（1.河北农业大学食品科技学院,河北保定071000）（2.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室,河北石家庄050091）摘要：根据市场上常见的肉类掺假情况，本研究通过提取生鲜牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉基因组DNA，按一定比例进行预混合，构建牛肉掺猪肉、羊肉掺猪肉、牛肉掺鸭肉和羊肉掺鸭肉4种掺假模型。通过引物COI-1和COI-2进行PCR扩增和测序比对，建立基于COI基因的动物源性食品的掺假判别方法。根据实验所得纯肉DNA提取率T实现DNA水平到肉水平掺假比例的换算。在肉的掺假水平上，引物COI-2检测效果较好，对牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型掺假物的检出限分别为5%、8%、1%和4%。对采集的28个批次的肉制品进行检测，结果表明：28个样品中89%的样品与产品标签标识的成分相符。建立的基于DNA条形码技术的检测方法可作为一种简单、快速、有效的分子鉴定技术，可以直接应用于研究物源性食品的种类和掺假鉴定。关键词：DNA条形码；肉；模型；掺假文章篇号：1673-9078(2016)8-295-301DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.8.045TechniquesforIdentifyingCommonMeatAdulterationsBasedonDNABarcodingTIANChen-xi1,2,ZHOUWei1,2,WANGShuang2,WANGZan2,ZHANGCui-Xia2,LIYong-yan2,ZHANGYan2,ZHANGZhi-sheng1(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071000,China)(2.HebeiFoodInspectionandResearchInstitute,HebeiFoodSafetyKeyLaboratory,Shijiazhuang050071,China)Abstract:Accordingtothecasesofcommonmeatadulterationseeninthemarket,fourkindsofadulterationmodelswerebuilt:mixedbeef-pork,mutton-pork,beef-duck,andmutton-duckbyextractinggenomicDNAsfromfreshbeef,mutton,pork,andduckandpremixingthematcertainratios.Throughpolymerasechainreaction(PCR)andsequencecomparisonusingtheuniversalprimersCOI-1andCOI-2,aCOIgene–basedmethodwasestablishedtodetectadulterationinfoodsofanimalorigin.AccordingtothepuremeatDNAextractionrateTobtainedfromtheexperiment,theconversionoftheadulterationratiofromtheDNAlevelintothemeatweightlevelwasachieved.Atthemeatweightlevel,COI-2primersprovidedarelativelyaccuratedetection,andthedetectionlimitsofbeef-pork,mutton-pork,beef-duck,andmutton-duckadulterationmodelswere5%,8%,1%,and4%,respectively.Themethodwastestedon28batchesofcollectedmeatproductsamples,andtheingredientsof89%oftheidentifiedsampleswereconsistentwiththosedescribedontheproductlabels.Asasimple,rapid,andeffectivemolecularidentificationapproach,DNAbarcodingcanbedirectlyappliedtodeterminetheanimalspeciespresentinfoodsofanimaloriginandtodetectadulteration.Keywords:DNAbarcoding;meat;model;adulteration近几年，在市场肉制品的生产与销售中，通过掺杂掺假、以次充好等手段欺骗消费者而牟取暴利的事件屡屡出现[1,2]，其中以价格低廉的猪肉或鸭肉掺假牛肉和羊肉的现象突出。对加工食品而言，物种的原始收稿日期：2015-09-24基金项目：河北省食药局科技项目（PT2014003）作者简介：田晨曦(1990-)，女，在读硕士，研究方向：农产品加工及贮藏工程通讯作者：张岩（1979-），男，博士，正高级工程师，研究方向：食品安全；张志胜(1970-)，男，博士，教授，研究方向：畜产品加工原理及技术研究可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难[3,4]。因此，迫切需要一些灵敏、可靠的检测方法来鉴定动物食品或动物源性加工食品的物种来源。DNA条形码技术(Barcoding)是近几年兴起的一种分子生物学新技术，由加拿大动物学家Hebert首次提出。其工作原理就是利用基因组DNA中一段标准的或者被公认的基因片段，作为分子靶标来进行种级水平的种类鉴定，类似于超市里识别商品的条形码[57]。在国外的研究中比较成熟[89]，国内对牛、羊、猪、鸭等肉类DNA条形码的研究依然处于初级阶段[10,11]，寻找现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.8296有较强特异性和通用性的基因片段作为肉类DNA条形码是迫切需要的。现阶段所采用的肉类掺假的鉴定方法不具备普遍的适用性，只能进行特异性检测，同时为了更好地提高掺假评估的准确性和通用引物的灵敏性，建立人工掺假模型并通过DNA条形码技术经行检测[12]。本研究将牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉的阳性DNA按一定比例进行预混合，构建4种肉类的掺假模型，分别取0.1g、0.05g和0.025g的牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉提取DNA，并计算DNA提取率T，根据纯肉DNA提取率T实现DNA水平到肉水平掺假比例的换算。利用DNA条形码技术对所建立的模型进行检测，以COI基因为目标片段，通过引物COI-1和COI-2进行PCR扩增和测序比对，建立基于COI基因的动物源性食品的掺假判别的方法。并对市售的肉类产品进行物种鉴定和掺假判定，为DNA条形码技术在动物源性食品鉴别中的应用提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂研究所用肉类阳性样本，牛肉、羊肉、猪肉、鸭肉购于大型超市，并利用SN/T3730、3731标准方法检测（结果略），以确保样本的准确性。动物基因组DNA提取试剂盒、PremixTaq、Marker、GelRed、琼脂糖购于上海生工公司。PCR扩增所用通用引物合成和PCR产物测序均由上海生工公司完成。1.2仪器与设备Sigma1-15pk冷冻离心机，德国Sigma公司；BS-124S分析天平，北京赛马利斯公司；NanoDrop2000微量核算蛋白测定仪，美国Thermo公司；LX-100手掌型离心机，江苏其林贝尔公司；PowerpacTmBasic电泳系统，美国伯乐公司；Bio-radChemiDocTmMp全能型凝胶成像系统，美国伯乐公司；S1000thermalcycler基因扩增仪，美国伯乐公司。1.3方法1.3.1DNA提取阳性样本及待测样本基因组DNA均采用组织基因组DNA提取试剂盒进行提取，①称取30mg肉样品，液氮研磨充分，转入2mL离心管，简短离心将样品沉入管底。②加入4μLRNaseA（100mg/mL），震荡15s，室温静置5min，以去除体系内的RNA。③加入20μL的ProteinaseK和200μL的裂解液GA（可适当增加），56℃振荡水浴2h，以充分裂解组织。④加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，待溶液变清亮。⑤加入200μL无水乙醇，充分振荡15s以混匀，全部转入吸附柱，12000r/min离心1min。⑥弃收集管废液，加入500μL缓冲液GD，12000r/min离心1min。⑦弃收集管废液，加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min。重复此步骤，漂洗两次。弃收集管废液，并再次离心以彻底去除漂洗液成分。将离心柱置于超净台数分钟，以彻底晾干漂洗液。⑧将吸附柱转入新离心管中，向吸附膜中间部位悬空滴加70μL的TE洗脱缓冲液，静置5min，12000r/min离心2min收集DNA。⑨将收集的DNA溶液再次加入吸附柱，静置2min，12000r/min离心2min富集DNA。利用Nanodrop2000检测提取DNA的纯度和浓度，提取的DNA浓度控制在浓度为4070ng/uL，OD260/OD280比值控制在1.8~2.1，可用于后续的实验或-20℃保存待用。1.3.2肉类DNA掺假模型设计根据市场上常见的掺假现象，设计了牛肉掺猪肉、羊肉掺猪肉、牛肉掺鸭肉和羊肉掺鸭肉4种模型。由于试验中小质量的纯肉掺假及掺假工艺无法很好地将两种肉混合均匀模拟实际中制售掺杂肉，造成实验误差较大，所以本实验采用肉类DNA进行掺假。掺假肉（猪肉或鸭肉）DNA与被掺肉（牛肉或羊肉）DNA的掺假比例为1:19、1:9、2:8、3:7、4:6、1:1。1.3.3纯肉DNA提取率的计算相同质量不同种纯肉所提出的DNA质量存在一定的差异，而DNA的掺假比例不一定是纯肉的掺假比例，所以要检测相同质量的牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉所提取DNA的质量差异。分别取0.1g、0.05g和0.025g的牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉按1.3.1的方法提取DNA，并换算DNA提取率T。根据纯肉的DNA提取率T得到公式：21221121M/AM)TM/()TM(DNA/DNA肉肉肉肉肉肉肉肉注：A为系数，M肉为纯肉质量，DNA肉为DNA含量。实现从DNA水平掺假比例到肉水平掺假比例的换算。1.3.4PCR扩增COI序列的通用引物选用本课题组所筛选出的引物COI-1和COI-2，对牛、羊、猪、鸭均具有很好的扩增效率及测序成功率。COI-1上游引物：5'CGAGCAGTAGCACAAACAATCTCAT3'，COI-1下游引物：5'GTTGGTCATAGCGAAATCGAGG3'；COI-2上游引物：5'TTCTCCAACCACAAAGACATT现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2016,Vol.32,No.8297GGCAC3'，COI-2下游引物：5'ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTGG3'。（引物COI-1来源文章已被现代食品科技录用）。PCR反应体系（50μL）：DNA模板5μL；PremixTaq25μL；正向引物（10μmol/L）2μL；反向引物（10μmol/L）2μL；以ddH2O定容到50μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s，54~58℃30s，72℃40s，反应36个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，使用凝胶成像系统分析扩增产物。1.3.5PCR产物测序及比对PCR产物送上海生工有限公司进行双向测序，测序引物同