PCR方法快速鉴别食品中肉的种类

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.71725PCR方法快速鉴别食品中肉的种类黄宇锋，罗海英，罗东辉，冼燕萍，覃芳芳，陈意光，郭新东，董浩（广州市质量监督检测研究院国家加工食品质量监督检验中心（广州）广州市食品安全检测技术重点实验室广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广东广州510110）摘要：本文针对食品中肉成分种类鉴别开发了一种快速灵敏的PCR检测方法，可检测食品中是否存在猪肉、牛肉、羊肉以及鸡肉等成分。采用微波助提法提取样品中DNA，简化了前处理步骤，可在短时间内完成从多种不同类型肉与肉制品中提取肉成分DNA。为了评价方法的可靠性与灵敏度，猪肉以及掺入了不同比例浓度猪肉成分的食品样品采用本方法进行了核酸提取与PCR分析。检测结果表明，方法可检测出低至含有0.5%浓度的猪肉成分的混合样品。随机抽取50份不同类型的市面食品样品，检测出5份食品含有猪肉成分，7份食品中含有牛肉成分，5份食品中含有羊肉成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中肉成分种类的检测鉴别。关键词：微波法；食品；肉制品；检测；引物文章篇号：1673-9078(2013)7-1725-1729RapidDetectionofMeatSpeciesinFoodbyPolymeraseChainReactionTechniqueHUANGYu-feng,LUOHai-ying,LUODong-hui,XIANYan-ping,QINFang-fang,CHENYi-guang,GUOXin-dong,DONGHao(GuangzhouQualitySupervisionandTestingInstitute,NationalCentreforQualitySupervisionandTestingofProcessedFood(Guangzhou),GuangzhouCityKeyLaboratoryofDetectionTechnologyforFoodSafety,GuangzhouCityResearchCenterofRiskDynamicDetectionandEarlyWarningforFoodSafety,Guangzhou510110,China)Abstract:Inordertodetecttheingredientsofpork,beef,mutton,chickeninfood,arapidandsensitivepolymerasechainreaction(PCR)methodwasdevelopedforthespecieidentificationofmeatingredientsinfood.Inthismethod,theDNAinthesampleswasextractedbymicrowaveirradiationtosimplifythepretreatmentstepandshortentheextractiontimeofDNAfromdifferentkindsofmeatandmeatproducts.Toevaluatethemethod,porkandfoodspikedwithdifferentconcentrationsofporktogetherwithunknownfoodsampleswereanalyzedbyPCRusingthenewsetofporcinespecificprimers.Thedetectionresultsshowedthatthelowestdetectablelimit(LOD)ofporkingredientbythismethodwas0.5%.In50randomsamplestested,5samplescontainedporkingredientand7samplescontainedbeefingredient.Another5samplescontainedmuttoningredient.Thismethodcanbewidelyusedinspecieidentificationofmeatingredientsinfood.Keywords:microwave;food;meatproducts;detection;primers俗语有云：“挂羊头，卖狗肉”，说明肉与肉制品的掺假售假现象由来已久，时至今日，一些唯利是图的生产经营者仍不择手段在食品生产流程中施行掺假，不法商贩在市场销售中以假乱真，用低质肉充优质肉从中取利。此外，随着贸易的全球化，食品更需要考虑不同国家、不同文化以及不同宗教的饮食习惯，收稿日期：2013-03-12基金项目：广州市科技计划项目([2011]233-34)作者简介：黄宇锋（1979-），男，硕士，工程师，研究方向为食品安全检测技术通讯作者：罗东辉（1982-），男，博士，高级工程师，研究方向为食品安全及风险预警并遵循相应规则，比如说猪肉在伊斯兰教、犹太教以及我国回族居民中的食用禁忌。由此可见，有效开展食品中肉成分的种类鉴别，具有重要意义。目前应用于肉与肉制品种类鉴别的方法较多，主要有形态学鉴别、免疫学鉴别、理化鉴别和分子生物学鉴别等方法，具体的高新技术分析方法包括PCR、HPLC、FTIR法等[1~8]。PCR是聚合酶链式反应的简称，是分子生物学中广泛运用的一种技术，主要原理是通过热循环，达到目的基因片段的大量扩增。目前这项技术越来越广泛地运用于食品来源种类的检测鉴别中。例如，覃芳芳等运用PCR技术检测牛奶和腊肠中的植物成分[9~10]，现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.71726陈文炳等运用PCR技术检测肉骨粉等产品中的动物源性成分等[11]，邓鸿铃等运用PCR技术检测食品中的转基因成分等[12]。结合先进的实时荧光定量PCR技术，以DNA为基础的检测技术在食品原材料种属鉴定中获得了快速的发展。相关研究表明，利用物种线粒体DNA序列作为扩增靶基因，通过合成特异性引物，扩增获得DNA片段，测序以及序列比对等手段可准确鉴别所分析物的物种种属。由于方法具有高度的特异性与敏感性，PCR技术在物种鉴别方面具有准确性高等优点。对于常规样品中DNA的提取与纯化，目前已有较多商业化的试剂盒应用于科研以及检测行业中。相关研究表明，这些试剂盒在PCR检测前的DNA提取中获得了很好的应用。然而针对大规模的样品筛查检测，试剂盒方法存在具有成本高，提取时间长等不足。为了降低研究成本和提高实验速度，本研究开发了一种快速检测食品中猪肉、牛肉、羊肉及鸡肉成分的PCR检测方法。该方法基于各物种不同的线粒体基因序列设计合成专一性的扩增引物，采用微波法提取样品中的核酸，根据扩增以及测序结果判断食品中肉成分种类。1材料与方法1.1实验材料与仪器猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉以及多种类型食品购自广州市场；TaqDNA聚合酶，DNA分子量标记，DL2000marker，购自Takara，大连宝生物工程有限公司。PCR热循环仪（MJResearch,PTC-200）、凝胶成像系统（Bio-Rad,GelDOXXR）、核酸蛋白分析仪（Bio-Rad,SmartSpecplus）、微量可调移液器（Eppendorf）。1.2样品处理方法以加工后的猪肉作为阳性对照，食品样品主要包括香肠、调味料、巧克力制品以及饼干等。这些样品均有独立的包装，在取样时为了避免污染，于取样室分别独立取样，于粉碎机中粉碎。为了防止污染，粉碎杯在取完每个样品后需要更换，粉碎杯在使用后立即清洗、消毒并灭菌。研磨粉碎均匀后，取5g样品，加入30mL预热的裂解缓冲液，裂解缓冲液配方为1mol/LTris-HCl，0.5mol/LEDTA，10%（m/V）SDS。将样品与裂解液混合溶液涡旋震荡15min，获得均质的溶液，置于室温(25~27℃)放置45min，每隔15min涡旋振荡5min。将样品置于4℃过夜，让样品充分裂解。1.3微波法提取样品DNA过夜消化后，样品涡旋震荡3min，放置10min让食品颗粒沉降，吸取上层清夜转移至1.5mLEppendorf管中。为了避免微波加热过程中Eppendorf管的变形或破裂，多个样品管应均匀对称放置于微波台上。并在微波室内放一杯蒸馏水，防止样品过热。放置好样品后，微波加热1~3min，经微波处理后的管内液体温度约为75~80℃。注意在微波提取过程中，管子应保持开启状态。微波提取后，离心，13000r/min离心5min。离心直至出现清澈的裂解液上清，离心后，转移上清至一新的离心管中，上清液即为DNA模板溶液。提取的DNA溶液的浓度采用核酸蛋白分析仪进行测定，测定260nm处的吸收值。1.4PCR检测在设计引物时，考虑到动物基因组中线粒体DNA拷贝数较多且抗腐蚀性较强，我们设计的引物基于各动物物种的线粒体基因序列。为了准确鉴别食品中所含肉成分的种类，我们根据猪、牛、羊、鸡各自的线粒体基因序列，分别设计了种属特异性的引物对提取的食品DNA进行PCR检测。具体引物信息见表1，引物合成于Invitrogen公司。表1引物信息以及扩增产物长度Table1InformationofprimersandthelengthofPCRproducts检测基因引物序列扩增产物长度/bp猪线粒体基因5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’149牛线粒体基因5’-gccatatactctccttggtgaca-3’5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’271羊线粒体基因5’-tattaggcctcccccttgtt-3’5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’294鸡线粒体基因5’-gggacaccctcccccttaatgaca-3’5’-ggagggctggaagaaggagtg-3’266PCR扩增采用TaqDNA聚合酶，反应体系为25μL体系，其中10×PCRbuffer2.5μL、MgCl22.5μL、dNTPs1.0μL、上、下游引物各0.5μL、Taq酶0.3μL，模板DNA30~50ng、灭菌双蒸水补足体积至25μL。PCR仪器反应条件为94℃预变性5min后，按变性94℃30s、退火依顺序分别为57/55/54/58℃30s、延伸72℃30s，共进行35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物于4℃保存。1.5琼脂糖凝胶电泳PCR反应结束后的PCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压80V，分子量标记为DL2000marker。凝胶内含有0.5μg/mL的溴化乙锭，凝胶成像系统下观现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.71727察、拍照。2结果与讨论由于PCR方法具有高度的专一性、敏感性且快捷简便，PCR方法目前已经广泛应用于食品的分析检测中。但是由于食品基质的复杂性，使得PCR技术在食品中的应用也受到了一定的限制。一般而言，在食品加工处理过程中，DNA分子存在不同程度的降解，食品加工辅料如添加剂、防腐剂等的引入也会对PCR反应带来一定的干扰。上述各类原因都可能会导致最终结果的不准确性。因此，急需开发更为科学有效的针对不同种类食品的DNA提取方法，方法应能基本除去食品中的添加剂、防腐剂等干扰物质成分，尽可能消除食品中干扰成分对后续应用如PCR反应的影响。本文开发的微波法提取食品中的DNA，由于在高温的作用下，以及处于pH6.0~9.0裂解体系的环境中，可以获得较高产量的DNA。与常规的煮沸法提取DNA相比较，微波提取DNA法由于微波辐射的能量很高，可以将样品的沸点提高25℃左右，更高的裂解沸点可以获得更快的DNA提取效率。微波处理后，通过高速离心，可以尽量减少食品添加剂等的干扰，获得满足检测要