2013分子实验考试

分子实验考试题型——名词解释（4道）简答题（3道）综合分析题（1道）一、名词解释:【复性】变性DNA在适当条件下，两条分开的互补单链可重新恢复双螺旋构象，这种现象称为复性。【质粒】质粒是染色体外的稳定遗传因子，能自主复制和转录并表达所携带的遗传信息。大小为1-200Kb，为双链闭环超螺旋DNA，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。【感受态细胞】如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。【转化】是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。【卫星菌落】某些载体带有β-内酰胺酶的基因，表达出β-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，β-内酰胺酶积累过多，就会使周围的氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，即出现卫星菌落。【PCR】聚合酶链式反应(PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。【转化效率】转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率。转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数(10)（注：稀释倍数=涂布前总体积／涂板用菌液体积）转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg)【酶切】限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。【连接】DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键，在有Mg2+、ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。【报告基因】GUS基因就是转β-葡萄糖醛酸酶基因，它存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一种水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其分解产物呈蓝色。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此GUS基因作为报告基因被广泛应用于基因调控的研究中。二、填空1、碱裂解法提取质粒的原理、主要试剂组成。【原理】质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。【试剂组成】1、E.coli5а(含pUC18或19质粒)？？2、溶液Ⅰ：葡萄糖（50mmol/L）；Tris·HCl（25mmol/L，pH8.0）；EDTA（10mmol/L）3、溶液Ⅱ：NaOH（0.2mol/L）；SDS（1%，新鲜配制）4、溶液Ⅲ：60ml的5mol/LKAC；11.5ml的冰醋酸；28.5ml水5、Tris饱和酚6、氯仿+异戊醇（24：1）7、无水乙醇8、70%乙醇9、ＴＥ缓冲液（pH8.0)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)10、RNaseA酶2、PCR反应体系的组成1、DNA模板：λ噬菌体的质粒DNA2、dNTP:4种dNTP混和物。3、10×PCR缓冲液(buffer)，具体组分如下:MgCl2、KCl、Tris.HCl(pH8.3)、明胶4、引物(primer):上游引物（M13F），下游引物（M13R）5、TaqDNA聚合酶3、感受态细胞生长状态和密度要求菌悬液在LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右(对数生长期）。注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。4、转化主要操作的目的质粒和感受态细胞混和：0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。热击：在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。复苏：使细菌恢复正常生长状态,即摄入了外源DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，并表达质粒编码的抗生素抗性基因Ampr（即外源基因）。当带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。5、限制酶的几大类型、识别和作用特点、条件？？根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。Ⅱ型限制性内切酶的主要特点：识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸（在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶），少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的（4-11）。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。影响酶切反应的因素：DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。三、简答题1、PCR原理聚合酶链式反应(PCR）是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。每经过一轮扩增，模板分子数增加一倍，经过n次循环后，模板分子数变为原来的2n倍。2、PCR变温程序具体操作中，包括几个阶段？每个阶段的作用、大致范围及如何设定。【变性】作用：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备？？大致范围：94-95℃，30秒。设定理由：变性不完全,往往使PCR失败，但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。【退火(复性)】作用：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合？？大致范围：50~60℃设定理由：通常PCR的退火温度选择为Tm-5℃。退火温度越高,所得产物的特异性越高。◇引物为20mer以下时：Tm=2℃×(A+T)+4℃×(G+C)◇引物为20mer以上时：Tm=81.5十0.41×(GC％)-600/L其中L为引物的长度【延伸】作用：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链？？大致范围：72℃，1-2kb/min设定理由：延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。循环数：35cycles。因为循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。3、碱裂解法提取质粒原理、溶液I、溶液II和溶液III作用【碱裂解法提取质粒原理】质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后,溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。【溶液I】1、低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀；葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA。2、EDTA的作用是螯合掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。3、Tris•Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。【溶液II】1、SDS的作用：破坏细胞膜；解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。2、NaOH(pH12)的作用：破坏氢键，使DNA分子变性。【溶液III】由KAc与HAc组成，是pH值为5.5的高盐溶液。1、能中和溶液II的碱性，使DNA复性。2、K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。4、连接的原理及反应体系组成、作用温度【连接的原理】核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+,ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。【反应体系组成&作用温度】体系：ddH2O、λDNA/EcoT14I片段(50ng/ul)、连接缓冲液、T4DNA连接酶作用温度：16℃for：1.粘性末端形成的氢键在低温下更稳定；2.连接反应时间长，低温下酶不容易失活5、CaCl2法转化的原理、蓝白斑筛选的原理【CaCl2法转化的原理】0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞可吸收外源DNA。摄入了外源DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。【蓝白斑筛选的原理】现在使用的许多载体都带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框；宿主细胞编码β-半乳糖苷酶C端部分序列。这样，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶（β-半乳糖苷酶）活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。四、综合分析题质粒DNA提取结果检测及分析（实例分析提取质粒DNA的质量及纯度，及电泳异常情况及其可能原因及改进措施）。