2012年酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定(12.6)

实验十酵母蔗糖酶的提取、分离纯化及其蛋白质浓度和酶活力测定蔗糖酶催化底物蔗糖分解成葡萄糖和果糖蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式:存在于细胞膜外细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50％（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式存在于细胞膜内侧细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶酵母细胞结构图酶是生物体内具有催化活性的物质，可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法和含量测定。酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及收率；依据其性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。本实验由四个分实验组成：蔗糖酶的提取与初步纯化蔗糖酶各级分酶活力的测定蔗糖酶各级分酶蛋白质浓度的测定离子交换柱层析纯化蔗糖酶分实验一：蔗糖酶的提取与初步纯化一、实验目的学习蔗糖酶分离提取的原理学习掌握细胞破壁、有机溶剂沉淀蛋白质的原理与操作二、实验原理细胞破碎的方法高压匀浆破碎法（homogenization）振荡珠击破碎法(SkakingBead)高速搅拌珠研磨破碎法（finegrinding）超声波破碎法（ultrasonication）机械法渗透压冲击破碎法（osmoticshock）冻融破碎法（freezingandthawing）酶溶破碎法（enzymelysis）化学破碎法（chemicaltreatment）去垢剂破碎法（detergents）非机械法蛋白质的沉淀蛋白质从溶液中以固体状态析出的现象作用机制主要是破坏了蛋白质水化膜或蛋白质所带的电荷主要沉淀方法：盐沉淀蛋白质——盐析重金属盐沉淀蛋白质某些酸类沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度下降；另一方面有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引力，降低其溶解度，因此使之发生沉淀反应。如把溶液的pH值调节到该蛋白质的等电点时，则沉淀更完善。在室温条件下，有机溶剂沉淀所得蛋白质往往已发生变性。若在低温条件下进行沉淀，则变性作用进行缓慢。利用机械法（二氧化硅研磨）破碎酵母细胞壁采用预冷的去离子水溶解破壁后释放出来的蔗糖酶离心去除酵母菌体而得到蔗糖酶溶液加热去除热不稳定的杂蛋白乙醇沉淀获得粗提酶。三、实验材料、仪器和试剂实验材料：安琪酵母仪器和试剂:研钵，离心管，滴管，量筒，恒温水浴锅，烧杯，高速冷冻离心机，pH值试纸二氧化硅，去离子水，冰，食盐，1mol/L乙酸，95％乙醇.四、操作步骤提取（1）准备冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中（2）称取3g干酵母粉和5g二氧化硅(石英砂)，放入研钵中（3）用量筒量取30mL预冷的去离子水，先加5ml左右研磨（若不够每次用滴管再加2mL左右水），边加边研磨成糊状（至少用30min），然后转移到100mL离心管中,最后用剩余的水洗净研钵中的物质并转移到离心管中，以便将蔗糖酶充分转入水相中。（4）平衡，4℃、10000rpm离心10min（5）将上清液倒入量筒，量出体积并记录，转入清洁烧杯中。（6）用pH试纸检查上清pH值，用1mol/L乙酸将pH值调至5.0。（7）将其置于50℃的水浴，经常缓慢搅拌，30min。（8）于冰浴中迅速冷却，倒入100ml的离心管中，4℃，离心10分钟。（9）取上清液，量体积并记录，得粗酶液1，同时预留2.0ml测定用。乙醇沉淀将粗酶液1转入小烧杯中，放入冰盐浴（碎冰、撒入少量食盐），逐滴加入等体积-20℃预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30min；再在冰盐浴中放置10min，使沉淀完全。4℃、10000rpm离心10min，弃上清，并滴干，记录为“醇级分2”，用5mL去离子水溶解后用于蛋白质含量和酶活力的测定。分实验二：蔗糖酶各级分酶活力的测定一、实验目的掌握蔗糖酶活力测定方法二、实验原理蔗糖酶能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过斐林试剂法测定还原糖的产生数量来测定。+蔗糖酶葡萄糖果糖蔗糖在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。斐林试剂法测还原糖含量灵敏度较高，其原理是：三、试剂碱性铜试剂磷钼酸试剂葡萄糖标准溶液0.2mol/L蔗糖溶液0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9四、仪器试管、试管架、移液管、分光光度计、比色杯、水浴锅等五、酶活力测定的步骤1.粗酶液1，醇级分2酶活力测定（1）首先用去离子水稀释粗酶液1：2000倍，醇级分2：5000、10000倍，（可取0.1mL加入25ml刻度试管，定容25mL，即稀释250倍）各管名称对照粗酶液1醇级分2葡萄糖对照葡萄糖管数12356稀释倍数2000倍5000倍/10000倍酶液/ml0.60.6水/ml0.610.8HAC-NaAC缓冲液0.20.20.22mmol/L葡萄糖/ml0.20.2mol/L蔗糖/ml0.20.20.2加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂终止反应。碱性铜试剂/ml11111立即用90－95℃水浴加热7－8min，立即用自来水冷却。磷钼酸试剂/ml11111水/ml55555A650nmE′=μmol/min.ml原始酶液酶活力E单位/ml(波长：650nm)一个酶活力单位Units定义为在给定的实验条件下，每分钟能催化1μmol蔗糖水解所需的酶量比活力，每mg蔗糖酶所具有的酶活力单位稀释后酶液的活力(按还原糖计算)：A650nm×0.2×2A’650nm×10×B（μmol/min×mL）式中：A650nm──第2,3,4管所测A650A′650nm──第6管所测A6500.2──第6管葡萄糖取样量2──标准葡萄糖浓度2mmol/L=2μmol/ml10──反应10minB──每管加入酶液mL数原始酶液的酶活力E=(E′/2)×稀释倍数E′=分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定（G-250法）实验目的实验原理仪器试剂方法波长为595nm1.标准曲线的制作（选用0.5cm比色皿）管号试剂012345样品粗酶液1（50X）醇级分2（50X）柱级分牛血清标准蛋白溶液（ml）100µg/ml00.20.40.60.81.01.01.0考马斯亮蓝（ml）2.52.52.52.52.52.52.52.5蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.2000蛋白质浓度（µg/ml）020406080100未知未知计算：1.计算并比较粗酶液I，醇级分II，获得的蔗糖酶的蛋白总量，及酶活力,并分析原因。蛋白总量=蛋白浓度×总体积总酶活=酶活×校正体积比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白纯化倍数=比活力之比回收率=总酶活之比2.各级分的纯化回收计算：级分记录体积/ml校正体积/ml蛋白质/mg/ml总蛋白量/mg酶活Unit总酶活力Unit*V比活/Unit/mg纯化倍数回收率％Ⅰ1.0100ⅡⅢ分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶一、实验目的学习掌握离子交换柱层析的原理与操作二、实验原理离子交换是指液相中的离子与固相交换基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素：DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。三、试剂阴离子交换剂DEAE0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液（含1mol/LNaCl）0.02mol/LpH7.3Tris-HCl缓冲液（含2mol/LNaCl）四、仪器层析柱部分收集器磁力搅拌器及搅拌子梯度混合器紫外检测仪紫外记录仪真空泵与抽滤瓶精密pH试纸或pH计五、操作步骤1.装柱与平衡将层析柱垂直装好，将DEAE引流装柱，然后用0.02mol/LpH7.3的Tris-HCl缓冲液洗柱，直至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时，稳定后即可上样。注意层析柱中不能有气泡，否则要重装2.上样与洗脱首先将前次实验放在-20℃的醇级分2取出，用5mL0.02mol/LpH值为7.3的Tris-HCl缓冲液稀释，混匀，4℃，10000rpm离心5min,取1.5ml用于测定。将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度洗脱[梯度混合器左侧放入50ml0.02mol/LpH值为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1mol/LNaCl），右侧放入等量0.02mol/LpH值为7.3的Tris-HCl缓冲液]。连续收集洗脱液，注意观察紫外检测仪的读值，注意标记其升高时对应的收集器中的试管，待蛋白峰过后A280nm值稳定后，记住标记此时对应的收集器中的试管。最后用0.02mol/LpH值为7.3的Tris-HCl缓冲液（含2mol/LNaCl）洗层析柱，洗去所有吸附在柱子上的物质。分组：3人一组