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植物组织中可溶性蛋白质含量的测定--考马斯亮蓝G–250染色法一、原理考马斯亮蓝G–250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质–染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料植物材料。（二）试剂1.标准蛋白质溶液（100μg／mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。2.考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％（W／V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。（三）仪器设备分光光度计，离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等。三、实验步骤1.标准曲线的绘制取6支试管，按下表加入试剂，摇匀，向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，并放置5min左右，以0号试管为空白对照，在595nm下比色测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。2.样品测定（1）样品提取称取鲜样0.25～0.5g，用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，3000r/min离心10min，上清液备用。（2）吸取样品提取液1.0mL（视蛋白质含量适当稀释），放入试管中（每个样品重复3次），加入5mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线查得蛋白质含量。绘制标准曲线的各试剂加入量试剂管号012345标准蛋白质（mL）00.200.400.600.801.00蒸馏水量（mL）1.000.800.600.400.200考马斯亮蓝G-250（mL）5.005.005.005.005.005.00蛋白质含量（μg）020406080100四、结果计算蛋白质单位（mg/g.FW）式中：C——查标准曲线值μg。VT——提取液总体积mL。WF——样品鲜重g。VS——测定时加样量mL。