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2014年分生网络课堂作业及文献1.断裂基因真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。2.单核苷酸多态性SNP是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。3.代谢组学通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或环境变化后），其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。4.毛细管电泳：以毛细管为分离通道、采用高压直流电场为驱动力的的新型液相分离技术，通过离子化合物的质荷比（m/z）不同造成迁移速率不同来实现分离。5.NMR：核磁共振技术，基于具有自旋性质的原子核在核外磁场的作用下，吸收射频辐射而产生的能级跃迁谱学，主要用于反映化合物结构中的H和C原子的位置信息，可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。6.genetherapy：基因治疗将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，最终达到治疗疾病的目的。7.stemcell：干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。8.CRISPR/Cassystem：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsassociated(Cas)）系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。基于细菌的这种免疫功能，人们把Ⅱ型CRISPR-Cas系统改造成一种全新的人工核酸内切酶，从而使该系统能够对靶基因进行修饰。9.生物大分子生物体内结构具有一定的规律性，由基本结构单位按一定顺序和方式连接而形成的多聚体成为生物大分子。其分子量一般大于10000.有蛋白质（包括酶）、多聚糖和核酸类化合物。10.酚抽提法本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。11.凝胶过滤层析凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。12.巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。13.Real-timePCRReal-TimePCR技术，又称实时定量荧光PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。常用：SYBRgreen（荧光染料法）和Taqmanprobe（探针法）。14.变性指在某些理化因素的作用下，维系核算二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。核算的变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部，但核酸变性不涉及核酸分子一级结构的变化。引起核算变性的因素有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等。其中加热使DNA变性是实验室最常用的方法。15.复性指的是变性核酸在适合条件下，两条互补链全部或部分恢复到双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm值低25~30℃时，即可复性，该过程通常称为退火。16.退火DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm值低25~30℃时，即可复性，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链，该过程通常称为退火。简答题1.简述真核生物基因组的结构与功能特点。答：1、基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞内基因组是双份的（即双倍体，diploid），有两份同源的基因组。2、基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录生成一个mRNA分子，再翻译生成一条多肽链。3、存在重复序列，重复次数可达百万次以上。4、基因组中不编码的区域多于编码的区域。5、大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的（断裂基因，splitgene）6、基因组远远大于原核生物的基因组，具有许多复制起始点，而每个复制子的长度较小。2.试述双向凝胶电泳技术的基本原理。答：1、第一向进行等点聚焦，在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质为两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。2、第二向在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成的电泳系统。SDS是一种阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质分子内，破坏蛋白质分子内的氢键及疏水作用，改变蛋白质分子的三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内的二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子间原有电荷的差异，沿垂直方向进行相对分子质量的分离。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中的迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质的分子量大小。3.分子克隆技术包括哪些基本步骤？答：1、目的基因的获取；2、载体的选择；3、目的基因与载体连接；4、重组DNA导入受体细胞；5、重组体的筛选。4.目的基因和载体连接主要有哪些方法？答：1、黏性末端连接；2、平末端连接：1）质粒和目的基因上没有相同的酶切位点，可用生成平末端的限制酶切割质粒和目的基因生成平末端，再用连接酶连接二者；2）人工接头连接；3、通过同聚尾连接。5.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。答：1、限制性核酸内切酶：简称限制酶，是一类能识别双链DNA特异的48个碱基对和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。功能：能识别双链DNA特异的4~8个碱基对，并在此序列内根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子。2、DNA聚合酶：1）DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性：①5→3DNA聚合酶活性；②3→5核酸外切酶活性；③5→3核酸外切酶活性，常用其水解的Klenow片段。功能：1.补齐双链DNA的3’末端，同时可使3’末端DNA标记同位素，2.在cDNA克隆中，合成cDNA的第二链，3.DNA序列分析。2）TaqDNA聚合酶，是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性。作用：用于DNA测序及通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增。3）反转录酶，是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA。功能：1.反转录作用，以单链RNA为模板，沿5’→3’方向合成DNA，催化合成RNA：DNA（cDNA）杂交链，2.核酸酶H的水解作用，沿3’→5’方向特异地水解RNA：DNA杂交链中的RNA链，3.依赖DNA的DNA聚合酶作用：以杂交链中的单链cDNA为模板，催化合成cDNA的互补链。4）末端脱氧核苷酰转移酶，分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上。功能1.在载体或目的基因3’末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接，2.用于DNA3’末端的同位素探针标记。3、DNA连接酶：称为基因工程的缝纫针，DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。作用：催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5’磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来。4、碱性磷酸酶：能催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团。作用：1.除去DNA片段上的5磷酸，以防自身连接；2.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，除去RNA或DNA上5端的磷酸。5、T4多核苷酸激酶：1.能够催化磷酸在g-位和双链/单链DNA或RNA的5'-羟基末端以及3'-单磷酸核苷间进行转移和交换。2.该酶还具有3'磷酸酶活性，将3'-磷酸基团从寡核苷酸的3'磷酸末端、脱氧3'-单磷酸核苷和脱氧3'-二磷酸核苷上水解掉。6、核酸酶S1：可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分。作用：1.除去粘性末端以产生平末端。2.除去cDNA合成时形成的发夹结构。3.分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况。6.举例说明载体应具备的基本要素。答：应具备基本要素：1、能自我复制并具较高的拷贝数。2、分子量一般10Kb。3、带有遗传筛选标记。4、有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选。书中以pBR322质粒为例，pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb。它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选。在这两个抗性基因中分别含有BamHI和PstI等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活。7.简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。答：双抗生素筛选：某些质粒载体如pBR322质粒中有Ampr和Tetr抗性基因，在这两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源DNA片段插入BamHⅠ识别序列时，则此质粒由Tetr变为对四环素敏感（Tets）。这种重组子导入宿主菌后，宿主菌在含四环素琼脂糖平皿上不能生长而在含氨苄青霉素的平皿上能够生长。在含四环素和氨苄青霉素的平皿上都能够生长的细菌只含有空载体。蓝白斑筛选：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内-互补，形成完整的-半乳糖苷酶，催化指示剂底物X-gal形成蓝色产物，结果重组克隆呈蓝色菌落。当外源基因插入lacZ基因中MCS，lac-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落，这是常用的蓝白斑筛选法。8.有哪些常用的探针标记物？答：放射性同位素标记：常用标记探针的同位素有32P标记的各种核苷三磷酸、3H标记的氨基酸或核苷酸、35S标记的氨基酸（最常用的是蛋氨酸）及其取代核苷三磷酸的α位磷酸基中的氧、125I标记的碘化钠溶液等；非放射性标记物：常用标记物有酶标记（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶）、荧光素标记（FITC；TRITC；四乙基罗丹明（RB200）；花青类染料）、生物素标记、光敏生物素标记、地高辛标记等。9.如何进行探针的标记？答：一、放射性同位素标记法：放射性同位素标记物：32P、35S、3H、125I等。同位素标记探针的方法：缺口平移法（双链）：该方法为双链DNA分子在适量的DNaseⅠ和Mg2+的存在下，被随机切开若干个缺口，缺口处形成3’-OH末端，此时