2015-4-26色谱分离技术.

1色谱分离技术2为什么要把色谱分离单独作为一章来谈？科研辅助招聘高校实验平台招聘色谱分离与其他技术连用LC-MSGC-MS等等测定技术基础3概述一、色谱法色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的的。4色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法，以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。5发展1941Martin和Synge液-液色谱理论；1952James和Martin发展了气相色谱；1956VanDeemter提出速率理论；1967Kirkland等研制高效液相色谱法；80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。6目前，工业规模的色谱技术已在产物提纯、分离、净化等方面得到广泛应用。大至工业化应用的的色谱系统：制糖工业（4m）；小至HPLC色谱柱250mm7在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。8当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用；由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异；因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同；从而按先后不同的次序从固定相中流出。9色谱法分类1.按两相状态分类气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。10液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。112.按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。12利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。133.按固定相的外型分类固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。144.按照展开程序分类分为洗脱法、顶替法和迎头法。洗脱法也称冲洗法。首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。15流出曲线如下图AB这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。16顶替法将样品加到色谱柱头后，在惰性流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直接用顶剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相。很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。17此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。AB顶替法的流出曲线如下图18迎头法将试样混合物连续通过色谱柱，吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。19分类按流动相气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱20按固定相在支持体中的形状柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率经典液相色谱高效液相色谱21色谱流出曲线及有关术语一、基本术语（一）色谱流出曲线和色谱峰由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。2223（二）基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。（三）峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。24色谱流出曲线和色谱峰基线（a）峰高（h）信号进样空气峰ha色谱流出曲线色谱峰25（四）保留值1.死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图。信号进样tM26因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相流动速度相近。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算，即ū=L/tM272.保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图。信号进样tR283.调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间，即tR´=tRtM由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，所以tR实际上是组分在固定相中保留的总时间。29保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响。因此色谱工作者有时也用保留体积来表示保留值。304.死体积V0指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco（cm3·min-1）计算。31(五)区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一。用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。321.标准偏差---即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半。2.半峰宽Y1/2---即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为Y1/2=2.3543.峰底宽度Y---即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是Y=43334从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：(i)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；(ii)根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；(iii)根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；(iv)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；(v)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。35色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远。两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。36二、分配系数K和分配比k1.分配系数K分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的吸附-脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。37它（K）是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的被分离组分浓度之比值，即K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm38分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值。它仅与两个变量有关：固定相和温度。但与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。392.分配比k分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的物质的量比。即k=组分在固定相中的物质的量/组分在流动相中的物质的量=ns/nm40k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被测组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。41k=ns/nm=CsVS/CmVm式中cs,cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。423.分配系数K与分配比k的关系K=kVM/VS=k.其中β称为相比，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6-35；对毛细管柱，其β值为60-600。43如果两组分的K或k值相等，则α=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。44若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：第一，两组分的分配系数必须有差异；第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。45第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，提出了相关的模型来解释和分析色谱过程，称为线性色谱理论。46色谱法研究的核心选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。47分离度分离度R是一个综合性指标。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率：指相邻两组分色谱峰保留值之差，与两组分色谱峰底宽总和之半的比值。即R=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)48R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R1时，两峰有部分重叠；当R=1时，分离程度可达98%；当R=1.5时，分离程度可达99.7%。通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。49不同分离度时色谱峰分离的程度50色谱定性和定量分析一、色谱的定性分析色谱定性分析就是要确定各色谱峰所代表的化合物。由于各种物质在一定的色谱条件下均有确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。各种色谱定性方法都是基于保留值的。51但不同物质在同一色谱条件下，可能具有相似或相同保留值，即保留值并非专属的。因此仅根据保留值对一个完全未知的样品定性是困难的。如果在了解样品的来源、性质、分析要求的基础上，对样品组成作初步的判断，再结合下列的方法可进行相关定性分析。52一）利用纯物质对照定性在一定的色谱条件下，一个未知物只有一个确定的保留时间。因此，将已知纯物质在相同的色谱条件下的保留时间，与未知物的保留时间进行比较，就可以定性鉴定未知物。若二者相同，则未知物可能是已知的纯物质；不同，则未知物就不是该纯物质。53注意纯物质对照法进行定性分析，只适用于组分性质已有所了解，组成比较简单，且有纯物质的未知物。54二）相对保留值法相对保留值αis是指组分i与基准物质s调整保留值的比值αis=tri/trS´=Vri/Vrs它仅随固定液及柱温变化而变化；但与其它操作条件无关。55相对保留值测定方法：在某一固定相及柱温下，分别测出组分i和基准物质s的调整保留值；再用已求出的相对保留值与文献相应值比较即可定性。基准物质的选择：通常选容易得到纯品的，而且与被分析组分相近的物质作基准物质。如正丁烷、环己烷、正戊烷、苯、对二甲苯、环己醇、环己酮等。56（三）加入已知物增加峰高法当未知样品中