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挺水植物对氨氧化微生物丰富度和群落结构的影响作者:张金平等(江苏大学)文章来源:生态工程影响因子:3.041(二区)摘要：采用克隆文库建设和定量的聚合酶链反应来研究三种挺水植物（黄菖蒲,再力花和香蒲）对氨氧化古生菌(AOA)和细菌(AOB)的丰富度和群落结构的影响。古生菌和细菌基因的丰富度分别为2.91×107到3.20×109和1.03×107到5.10×108。在钙研究领域，香蒲组的AOA和AOB表现出最高的丰富度，黄菖蒲的AOA丰富度和多样性高于再力花，但AOB的丰富度比再力花低。在AOA中观察到亚硝化暖菌属，泉古菌属和亚硝化菌属，其中亚硝化暖菌属占主要组成。此外，在AOB中发现亚硝化单胞菌和亚硝化螺菌属，其中亚硝化螺菌属占支配地位。在有或者没有氨苄青霉素时实验样品中潜在的硝化率表明AOB在无植被和黄菖蒲沉积物中的硝化过程中是重要的，然而AOB可能在其他植物的硝化中占支配地位。关键词：氨氧化古生菌氨氧化细菌多样性挺水植物根际1引言植物根际周围有着比非根际环境高数量的微生物和新陈代谢活动，大量的生物种类和复杂的生物群落。植物发达的根系为微生物和根际沉积提供了适宜的生态位，为附着微生物提供了大量的易降解有机碳。挺水植物的根系通过特殊结构（根和肥厚的茎）释放氧，与无植被沉积环境相比，这一过程促进了根基周围硝化反硝化过程。已经在稻田土壤中研究了硝化反硝化细菌组合的微生物群落。然而，在淡水沉积物中，尤其是挺水植物根际周围，这一领域还有没有研究。作为硝化过程的第一步和限制过程，氨氧化在全球氮循环中占有重要地位。这一过程可以通过两组原核微生物来促进完成，叫做氨氧化古生菌和氨氧化细菌。氨氧化古生菌被认为是泉古菌门，后来基于基因学和种系命名学更名为古菌。研究展示了AOA的存在形式和其在陆生和水生生物中相对于AOB的优势，然而，这两种微生物群落的物种丰富度因大型植物的不同而不同。由此大致推测植物种类影响氨氧化微生物的丰富度。此外，AOA和AOB的群落结构根际和有无沉积物的不同而不同，由此推断植物物种对微生物群落结构能够产生影响。目前的研究主要是研究挺水植物根际和非根际沉积物中AOA和AOB的物种丰富度。本研究旨在确定挺水植物对根际沉积物中的氨氧化微生物的丰富度和群落结构的影响，实验采用三种植物分别是黄菖蒲，再力花和香蒲，均从金山公园采集而来。这三种植物普遍生活在湿地系统中，具有吸收营养物质和释放氧的特性。黄菖蒲倾向于以硝酸盐为氮源，再力花和香蒲以氨为氮源。黄菖蒲根系的释放氧气的速率高于香蒲。2材料与方法2.1采样点介绍和样品收集于2013年7月31日在江苏苏州金山湖岸边采集黄菖蒲,再力花和香蒲根际和非根际沉积物，这一地区受亚热带季风气候影响，年平均气温和降水分别为15.6摄氏度和1088.2mm。金山湖是一个人工湖，水位低于4.2米，在采样点，水文条件相对稳定且相似，没有内涝发生。每一个取样位置包含五个采样点（30cm×30cm×30cm），通过抖落松散地吸附在根上的沉积物来收集根际样品，而分离的沉积物被作为非根际样品，同时没有植被覆盖的沉积物作为对照。收集的沉积物迅速被保存在无菌的密封袋中保存在冰带中，运送到实验室。从相同植物周围采集的样品完全混合，然后用2mm筛去除植物残渣和杂质，每份沉积物样品被分成两份，用于物理化学分析和分子鉴定，后者样品被保存在-20摄氏度环境中。2.2物理化学分析采用PHS-3C数字pH计测沉积物水溶液pH值，水溶液配比为2.5:1。通过重铬酸盐氧化法测有机质浓度。采用2MKCl萃取铵态氮和硝态氮，然后采用靛酚蓝和酚二磺酸方法来测定。采用半微量Kjeldahl方法测总氮。采用抗坏血酸钼蓝方法测定总磷，每一个参量测定三次。2.3DNA提取，PCR扩增和克隆文库建设采用FastDNA1SPIN法从0.5g沉积物样品中提取DNA，每一个样品测定三次，并混合。针对古细菌和细菌的功能基因氨单加氧酶α亚基进行标记选出样品中的AOA和AOB，分别采用Arch-amoAF/Arch-amoAR和amoA-1F/amoA-2R作为AOA和AOB的引物。通过PCR反应进行先期描述。通过PCR凝胶抽提法获取PCR产品。纯化的基因片段然后接入pMDTM19-T载体然后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。对于每一个样品，至少随机选取50个转化子并采用Msp1和Hha1限制酶分析限制性片段长度多态性，在分析限制性片段长度多态性后，为每一个基因库选取20个基因并在SangonBiotech.公司进行排序。2.4进化分析通过与基因库基因序列联机分析获取的基因序列以确定这些基因是属于氨氧化微生物的基因。对于AOA和AOB，这些基因中有超过95%的基因序列相似的归为同一单元（OTU）。通过这些OUT分类，在基因银行中选出最有代表性的和最相似的基因，此外，这些最有代表性的基因可以用于进化分析。基因库中这些典型的基因和多种多样有名的基因采用邻接法构建基因系统树。对1000个复制品进行自展分析来估计树节点的可信度。2.5古细菌和细菌amoA基因量化通过CFX96TMPCR检测系统量化PCR反应，2.3中引物集结点用来量化沉积物中古细菌和细菌的丰富度。20μL中包含10ng的模板，0.5mM的每种引物和10mL的主混合物，反应在95摄氏度下进行10分钟，然后分别在95摄氏度、53摄氏度和72摄氏度下在30s时间内进行40个周期，并记录每一个周期。通过熔解曲线分析确认产品特异性。通过使用SanPrep微型质粒试剂盒从样品中萃取质粒。对于每个基因和引物组，对反应物进行重复测定三次。2.6潜在硝化速率通过动摇浆法测定潜在硝化速率。简单地说，将10g鲜土加到250ml的锥形瓶中，其中含有100ml的培养液，pH值调节到7.4，培养液中含有0.2MKH2PO4和0.2MK2HPO4和0.05M(NH4)2SO4其体积比为3:7:30。每一组样品保存在-20摄氏度环境中，试验样品在180转/分条件下振荡1个小时，然后28摄氏度条件下在ZGX-300C恒温箱中培养24小时。培养后，用5ml的2MKCl萃取亚硝态氮和硝态氮并进行测定。潜在硝化速率是基于实验前后NO2--N+NO3--N浓度变化来估计的。在平行实验中，加入1g/l的安比西林到容器中区分古细菌和细菌的氨氧化率。广谱抗生素氨苄青霉素可抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，但不抑制古细菌的。2.7统计分析amoA基因大致的覆盖率之前已经研究过，运用DOTUR程序获得非参数性丰富度估量Chao1和香农多样性指数。SChao1是基于罕见物种，然而，更多的物种和更高的种间均匀性经常表现出更高的香农多样性指数。运用Canoco4.5来分析微生物群落结构和周围环境因素额关系。运用SPSS19.0进行统计分析单项方差分析，成对样本t检验和威尔逊相关系数，所有分析的统计学显著性在P0.05或0.01。2.8核苷酸序列登录号本研究所获得的基因序列储存在基因数据库中，其中AOA和AOB的登陆码分别为KM030706-KM030834和KM030936-KM031050。3讨论3.1沉积物的物理化学性质沉积物的pH范围是7.04-8.12，为中性或偏碱性沉积物，控制沉积物出现最高沉积物，而可证明的最低pH值。此外，三种植物根际沉积物展现出比非根际沉积物较低的pH值，他们的pH值显著不同。相比之下，相比之下，根际沉积物中的氨氮和总氮浓度比非根际沉积物中的高，在控制沉积物中出现最高值。根际、非根际、控制和植物的沉积物以及不同植物物种间的氨氮浓度显著不同。这些发现表明，植物种类影响沉积物的物理化学性能。NO3—N和OM表现出与NH4+-N和TN相似的趋势，在控制沉积物中检测到最低浓度。与这些参数相比，TP表现出明显的趋势。非根际周围沉积物表现出比根基周围沉积物更高的TP浓度。3.2AOA和AOB的差异表2表示了129个基因序列分为13个单元，115个基因序列分为24个单元，对AOA和AOB每一个样本的覆盖率达到了80%，表明目前的研究出现了可靠的结果。AOA的SChao1值范围为2.00到7.50。非根际沉积物比根际沉积物有更高的丰富度，除了再力花。黄菖蒲实验组表现出比香蒲更高的AOA丰富度和多样性。对于AOB值，三种植物中非根际沉积物中表现出比根际沉积物中更高的丰富度。此外，黄菖蒲相关沉积物中的丰富度比其他物种低。AOB的多样性使得TP和OM相联系。另外，再力花和香蒲相关沉积物中AOB表现出比AOA更高的物种丰富度和多样性，然而，在控制沉积物和黄菖蒲沉积物中则表现出相反的结果。3.3AOA和AOB的系统发育分析共有129个AOA序列隶属于Nitrososphaera，Nitrosopumilus和Nitrosotalea集群的比例分别为92.25％，6.98％和0.78％（如表2和表3）。谱系名来自各相应组的第一培养代表组。在这项研究中Nitrososphaera集群包含在三个不同的植物种类中得到的序列，这些序列均与来自河口沉积物和有关土壤。在Nitrosopumilus集群中，没有发现来源于T.银荆相关沉积物的序列，而从黄菖蒲中隔离出Nitrosotalea群中一个独特的序列。在这三种植物，香蒲中Nitrososphaera集群的比例最低（21.85％），但Nitrosopumilus集群最高（55.56％）。如图2和3b中所示，所获得的115AOB序列包括Nitrosospira和亚硝化集群，分别为占AOB组的79.13％和20.87％。这两个集群拥有从三种植物物种的有关沉积中得的序列。根据植物种类没有形成明显的模式。在三种类型的植物中，再力花含有亚硝化集群的比例最高（41.67％），但Nitrosospira集群的比例最低最低（26.37％）。3.4AOA和AOB的群落结构如图4a中所示，TD,N-TD和N-TO形成独特的Nitrososphaera集群。其他样本含有至少两种微生物集群。N-IP中检测到三种微生物集群。Nitrosopumilus集群的比例最高达到31.25%。Nitrosotalea仅仅占N-IP中的5%。对于AOB（如图4b中所示），Nitrosomonas和Nitrosospira能够在每一个样本中检测到，后者占主导地位。Nitrosomonas在控制沉积物中占最低的比例，比其他样本中略高，在TD中达到最高比例。与IP相比较，,TD和TO中Nitrosomonas表现出比N-TDandN-TO较高的占有率，此外，冗余分析（RDA）表明，AOB群落结构，OM（P=0.006，F=4.14,1000排列）和pH值（P=0.033，F=3.19）分别为显著相关。3.5AOA和AOB的丰富度定量PCR分析结果进一步表明了AOA和AOB在植物根际和非根际沉积物中的存在和丰富度，分别为2.91×107到3.20×109和1.03×107到5.10×108。（图6）此外，AOA/AOB比例变化从2.20到6.27，说明古细菌中amoA基因比细菌中的多。在上述7个样品，控制沉积物含有最低AOA和AOB丰富度，而从香蒲沉积物中的最高。发现不同的植物根际和非根际沉积物之间出现显著的差异。威尔逊相关分析（表2）表明，AOA丰富度随pH显著负相关，但与OM正相（P0.05）;此外，AOB丰富度显著，与OM（P0.05）显著相关。3.6PNRsPNRs变化范围为1.707mgkg-1h-1到9.347mgkg-1h-1（图7）。样本之间的关系如下：TON-TOTDN-TDIPN-IPCT。这表明根际沉积物中表现出较高的PNRs值。威尔逊相关分析发现PNRs与NO3—N、OM显著的且确定的联系。此外，PNRs与AOA、AOB和OUT指数有显著的确定的联系。添加氨苄青霉素样品的PNRs表现出与没有氨苄青霉素相类似的趋势。样本中有无氨苄青霉素的PNRs值是显著不同的，除了在控制沉积物和黄菖蒲沉积物中。4讨论对三个不同的挺水植物的根际和非根际沉积物中检测其丰富度，多样性，系统发育和氨氧化微生物群落结构。这项研究提供了