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ISO15189认可对分子诊断设备的要求及应用中的问题沈佐君shenzuojun@163.com主要内容一、开展分子诊断检测的国家及行业相关规定二、开展分子诊断检测涉及的主要设备三、ISO15189在分子诊断领域的应用说明简介四、ISO15189对分子诊断设备的性能要求五、ISO15189对分子诊断检测的系统完整性要求六、分子诊断设备制造商在帮组用户通过ISO15189认可过程中应注意的问题第一部分开展分子诊断检测的国家及行业相关规定•分子诊断的基本概念•基因体外扩增检验，通常称为PCR检验•2002-2009年:该检验项目是目前我国临床检验项目中唯一一项需要通过卫生部或省级临床检验中心现场技术验收合格方可开展临床检验的技术准入项目。•2009年5月1日后：卫生部关于印发《医疗技术临床应用管理办法》的通知（卫医政发〔2009〕18号）和《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医政发〔2010〕194号）。医疗技术分为三类：第一类：医疗技术是指安全性、有效性确切，医疗机构通过常规管理在临床应用中能确保其安全性、有效性的技术。第二类：医疗技术是指安全性、有效性确切，涉及一定伦理问题或者风险较高，卫生行政部门应当加以控制管理的医疗技术。（如PCR）第三类：医疗技术是指具有下列情形之一，需要卫生行政部门加以严格控制管理的医疗技术：（1）涉及重大伦理问题；（2）高风险；（3）安全性、有效性尚需经规范的临床试验研究进一步验证；（4）需要使用稀缺资源；（5）卫生部规定的其他需要特殊管理的医疗技术。（共19项，第8项基因芯片诊断技术，现划为第二类）卫生部负责第三类医疗技术的临床应用管理工作。第三类医疗技术目录由卫生部制定公布，并根据临床应用实际情况，予以调整。省级卫生行政部门负责第二类医疗技术临床应用管理工作。第二类医疗技术目录由省级卫生行政部门根据本辖区情况制定并公布，报卫生部备案。医疗技术临床应用能力审核属于第三类的医疗技术首次应用于临床前，必须经过卫生部组织的安全性、有效性临床试验研究、论证及伦理审查。第二类医疗技术和第三类医疗技术临床应用前实行第三方技术审核制度。对医务人员开展第一类医疗技术临床应用的能力技术审核，由医疗机构自行组织实施，也可以由省级卫生行政部门规定。卫生部指定或者组建的机构、组织（以下简称技术审核机构）负责第三类医疗技术临床应用能力技术审核工作（1.中国医学科学院、2.中华医学会、3.中国医院协会、4.中华医师协会、5.中华口腔医学会）。省级卫生行政部门指定或者组建的技术审核机构负责第二类医疗技术临床应用能力技术审核工作。卫生部可以委托省级卫生行政部门组织对指定的第三类医疗技术进行临床应用能力技术审核工作。对开展分子诊断检测实验室的要求：•实验室流程布局•人员上岗证书•实验室的管理（参照ISO17025，10章38款）•规范的应该是：实验室验收合格证书（技术审核报告）+卫生行政部门的登记（诊疗科目）第二部分开展分子诊断检测涉及的主要设备主要设备（5.5检验过程）1、核酸提取仪2、PCR（1）普通PCR仪（2）实时荧光PCR仪（3）液体芯片3、杂交仪4、基因芯片5、一体化/工作站6、测序仪辅助设备（5.2设施和环境条件）1、加样器2、金属浴3、离心机4、冰箱5、生物安全柜6、UPS7、纯水器（能除RNA酶）第三部分ISO15189在分子诊断领域的应用说明简介：5.2、5.3、5.5及附录医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明CNAS-CL362014年4月21日第一次修订，2014年11月1日实施1范围本文件规定了CNAS对分子诊断领域的认可要求，包括：病原体核酸和人体基因等领域涉及的核酸扩增试验、杂交试验（包括解剖病理中的原位杂交试验）、核酸电泳分析等。注：“分子诊断”包括检验医学领域的“分子检验”以及病理学检查领域的“分子病理”。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本文件。GB/T20468-2006临床实验室定量测定室内质量控制指南CNAS-RL02能力验证规则CNSA-CL31内部校准要求临床技术操作规范·病理学分册医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则病理科建设与管理指南（试行），卫办医政发〔2009〕31号3术语和定义•标本接收与处理：流程和标本是否合格的要点•试剂耗材质检：为何要质检、如何做•核酸提取：原理和操作技术要领•防污染：措施和意识•质量控制：程序和实际运行情况、失控的分析处理•结果分析与判断：结果审核、报告发放评审中考核的主要内容5.2设施和环境条件5.2.1应实施安全风险评估，如果设置了不同的控制区域，应制定针对性的防护措施及合适的警告。5.2.2涉及基因扩增检验的实验室原则上分四个独立的工作区域：试剂贮存和准备区；样品制备区；扩增区；扩增产物分析区。如使用自动分析仪（扩增产物闭管检测），扩增区和扩增产物分析区可合并。具体实验室分区应依据其所使用的技术平台及检验项目和工作量而定。上述每个区域应有充足空间以保证：•样品处置符合分析前、后样品分区放置；•仪器放置符合维修和操作要求；•样品制备区放置生物安全柜、离心机和冰箱等仪器设备；•打印检验报告时交叉污染的控制。5.2设施和环境条件工作区域应符合如下要求：•c）实验室各分区应配置固定和移动紫外线灯，波长为254nm，照射时离实验台的高度一般为60～90cm；•e）样品制备区应配置二级生物安全柜和洗眼器，实验室附近应有喷淋装置。•所有分子病理实验室均应设置独立的标本前处理区，包括切片区和脱蜡区，用于组织切片、脱蜡、水化、染色等。脱蜡、水化及染色应在通风设施中进行。5.2设施和环境条件•5.2.3用以保存临床样品和试剂的设施应设置目标温度和允许范围，并记录。实验室应有温度失控时的处理措施并记录。•5.2.6不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。工作结束后应立即对工作区进行清洁，必要时进行消毒及去污染。应依据所用分析设备和实验过程的要求，制定环境温湿度控制要求并记录。应有温湿度失控时的处理措施并记录。扩增仪应配备不间断电源（UPS）；应依据用途（如：RNA检测用水），制定适宜的水质标准（如：应除RNase），并定期检测。分子检验各工作区域应有明确的标记。进入基因扩增实验室各工作区应按照单一方向进行，即试剂贮存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区。不同的工作区域宜使用不同的工作服（如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不应将工作服带出。5.3实验室设备、试剂和耗材•5.3.1.1如从事RNA检测，宜配备－70℃的冷冻设备。需要时，配备高速冷冻离心机。标本制备区使用的一次性加样器吸头应带有滤芯。PCR试验用容器应可密闭，不同工作区域内的设备、物品不能混用。•组织标本前处理区的设备通常应包括切片机、裱片机、切片刀、电热恒温箱、脱蜡缸、水化缸及HE染色缸等。5.3实验室设备•5.3.1.4应按国家法规要求对强检设备进行检定。应进行外部校准的设备，如果符合检测目的和要求，可按制造商校准程序进行。应至少对分析设备的加样系统、检测系统和温控系统进行校准（适用时）。分析设备和辅助设备的内部校准应符合CNAS-CL31《内部校准要求》。•ABI5700FAM™/SYBR®GreenI，VIC®/JOE™，NED™/TAMRA™/Cy3®，ROX™/Texas-Red®和Cy5®•应定期对基因扩增仪、加样器、温度计、恒温设备、离心机和生物安全柜等进行校准。样本升降温速率：快速模式：－1.6-＋0.8℃/秒标准模式：±1.6℃/秒加热块最高升降温速率：2.5℃/秒温度范围：4℃-100℃温度精度：设置值/显示温度的±0.25℃(35℃至95℃)(时钟启动后3分钟开始测量)温度均一性：±0.5℃(35℃至95℃)(时钟启动后30秒开始测量)光学系统：五色激发光滤光片，五色发射光滤光片和CCD成像系统安装时已校准染料：SYBR®GreenI，FAM™，VIC™，JOE™，NED™，TAMRA™，ROX™，TexasRed®，Cy3™，Cy5™。被动参照染料：ROX™5.3实验室设备5.3.1.5设备故障后，应首先分析故障原因，如果设备故障可能影响了方法学性能，故障修复后，可通过以下合适的方式进行相关的检测、验证：(a)可校准的项目实施校准验证，必要时，实施校准；(b)质控物检验；(c)与其他仪器或方法比对，偏差符合附录A.3的要求；(d)以前检验过的样品再检验，偏差符合附录A.5的要求。5.3实验室设备5.3.2.1实验室应建立试剂和关键耗材（如离心管、带滤芯的吸头）的验收程序，相应程序中应有明确的判断符合性的方法和质量标准（宜参考附录A）。5.3.2.3实验室应对新批号或同一批号不同货运号的试剂和关键耗材进行验收，验收试验至少应包括：外观检查：肉眼可看出的，如包装完整性、有效期等；性能验证：通过实验才能判断的，如试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率、试剂的批间差异、关键耗材的抑制物等。5.3实验室设备试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率。一般情况下，临床实验室在新批号试剂或关键耗材使用前，应验证试剂批间差异和耗材的抑制物，符合附录A.6要求即可视为满足要求。特殊情况下，如实验室怀疑提取试剂有质量问题，可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确认核酸片段提取的完整性、260nm紫外波长测定确认核酸提取的产率、260nm/280nm比值确认核酸提取的纯度。靶核酸提取的质量纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。核酸提取的产率：可在A260读数测定。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果。用于定性检验的试剂，选择阴性和弱阳性的样品进行试剂批号验证。用于定量检验的试剂，应进行新旧试剂批间的差异验证，方法和要求参照附录A.6要求。耗材的抑制物验收：对关键耗材应检测是否存在核酸扩增的抑制物，方法和要求参照附录A.6要求。5.3实验室设备试剂质检强调采用患者标本进行试剂质检的意义：•PCR实验时两个关键步骤：（1）从标本中提取核酸；（2）提取核酸的扩增。•商品化的质控品和标准曲线的结果良好，并非能反映提取试剂的质量。推荐的试剂质检方案•标本选择：一般选择已用老试剂测定过的患者标本5份，其中一份阴性，其余4份一般要尽可能涵盖高、中、低、临界等浓度差。•结果判断：用新试剂重复测定上述5份标本，计算偏差(%)；判断标准(根据实验室室内质控RCV和能力验证允许总误差TEa)；关注临界值和高值！5.5检验过程5.5.1.2定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少应包括精密度、正确度、线性、测量和/或可报告范围、抗干扰能力等。定性检测项目验证内容至少应包括测定下限、特异性、准确度（方法学比较或与金标准比较）、抗干扰能力等。验证结果应经过授权人审核。应使用验证过的核酸抽提和纯化方法，必要时进行核酸定量。对产前检验，在完成分子诊断前应保留备份培养物并跟踪监测实验的准确性；在检验胎儿标本前，应检验父母一方或双方的突变状态，宜由同一实验室检验；如有足够的标本，应从两份不同标本中提取DNA进行双份检验。实验室应了解检验方法受母体细胞污染的影响，应有程序评估并减少这种影响。应有明确和统一的原位杂交（ISH）阳性信号的标准，并建立本实验室的阳性阈值。组织病理ISH，应结合组织形态进行结果判读，并采用国际通用的评分标准。5.5检验过程5.6检验结果质量的保证5.6.2.1总则应制定室内质量控制程序，定量测定可参照GB/T20468-2006《临床实验室定量测定室内质量控制指南》。质量控制程序中应有针对核酸检测防污染的具体措施。应保留DNA质量评价记录。需要时，应对RNA的质量进行评价，并选择合适的“管家”mRNA作为内对照以