17其它的分子诊断检测技术2013-12-19

其它的分子诊断技术检验医学院周兰分子诊断学可以检测基因突变的方法及其优缺点本章内容1基因突变相关知识和检测技术的复习和总结2基因变异检测技术3脉冲电场凝胶电泳4分子影像1基因突变相关知识和检测技术的复习和总结1-1染色体突变（chromosomemutation）指染色体结构和数量的变异（包括：缺失、重复、倒位和易位），致染色体遗传病**涉及的基因较多**可经光学显微镜分析有丝分裂中期染色体来检出**可在细胞的有丝分裂间期用标记探针检出（染色体原位杂交）Dual-colorFISH检测白血病细胞间期核的费城染色体BCR基因呈红色，ABL基因呈绿色，融合基因呈黄色融合基因费城染色体（BCR-ABL）的检测显示这段附加的染色体来源于2号染色体(M-FISH)9号染色体短臂上的附加段来自？（Rx-FISH)细胞分裂中期的染色体1相关知识和检测技术的复习和总结1-2缺失、重复和插入（涉及多个碱基）引起移码突变，即DNA片段中某一位点插入或丢失一或几个（非3或非3的倍数）碱基时，可致其后的全部编码顺序发生错位的一种突变1-3点突变（pointmutation）是肿瘤和遗传病发生的主要分子机制(癌基因激活和抗癌基因失活等），是基因突变分析的主要内容点突变的类型点突变：即单碱基替换（singlebasesubstitution）指由单个碱基改变发生的突变，包括：*转换（transition)：一种嘌呤被另一种嘌呤取代或一种嘧啶被另一种嘧啶取代*颠换（transversion）：嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤1-4点突变的检测方法1）PCR+探针：PCR-ASO等2）PCR+其它技术：PCR-SSCP,PCR-RFLP3）连接酶链反应（LCR）4）PCR+DNA芯片技术5）PCR+DNA测序:实行单分子测序后，勿需PCR......6)PCR扩增阻碍突变系统镰贫的ASO探针法检测一对探针（20bp左右），标记后用于杂交检测等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleatide,ASO）突变型遗传病的直接基因诊断产前诊断SSCPRFLP：基因结构的改变导致酶切位点数目变化，因此酶切产生的片段的长度和数目也随之改变；通过与正常对照组比较，即可推断被分析的目的片段是否有结构改变AG总长10kb酶切后3和7kb图8-14LCR反应原理示意图优势：能够准确分析基因序列中单个碱基突变。因此，在遗传病、肿瘤诊断、细菌和病毒的分型及致病力的鉴定中具有重要作用LCR遗传性耳聋基因检测芯片（图）乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片耐药性结核杆菌基因突变检测芯片2基因变异检测技术2-1PCR扩增阻碍突变系统2-2寡核苷酸连接实验2-3温度梯度凝胶电泳和变性凝胶电泳2-4变性高效液相色谱法(自学）2-5错配接合蛋白质截短测试法1989年在PCR基础上发展起来的、通过PCR和凝胶电泳检测DNA中各种已知点突变的新方法PCRamplificationrefractorymutationsystem又：PCRamplifcationofspecificalleles,PASAalleles-specificPCR,ASPCR2-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)1)基本原理TaqDNA聚合酶无3’－5’外切酶活性，不能纠正3’端的错配，因此对于Taq酶的扩增，3’端必须完全配对，以实现高效扩增当PCR的引物的3’端与模板之间存在错配时，PCR的扩增效率极差，甚至完全不扩增即“扩增阻碍”2-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)1-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)设计两个5’端引物，突变点位于其3’端A:与正常DNA互补（其3’端与突变基因不匹配)B:与突变DNA互补（其3’端与正常基因不匹配)设计一个公用的3’端引物（C）利用这2对引物分别扩增样本（A,C/B,C）然后,电泳检测1-1PCR扩增阻碍突变系统(PCR-ARMS)结果：*突变引物(B,C)扩增突变基因，正常基因扩增受阻*正常引物(A,C)扩增正常基因，突变基因扩增受阻结果判读2）应用（1）检测单个位点的突变（2）检测多个位点的突变：借鉴多重PCR原理，可同时检测4-6种等位基因突变位点（3）基因分型（纯合突变或杂合突变）（1）检测的特异性依赖于反应条件的优化，即不允许引物与靶DNA在错配时出现延伸可通过提高复性（退火）时引物与模板杂交的严格度来提高检测的特异性（2）可借助多重PCR同时检测多个点突变，不用放射性标记，不需要昂贵的试剂及复杂的检测系统，是多点突变检测的理想方法（3）缺点：只能检测已知的基因突变（或多态性）3)方法的特点2-2寡核苷酸连接实验（OLA)1）原理：设计两个相邻的寡核苷酸探针（约20nt），其相邻的位点正好是已知的突变位点，探针与靶序列杂交后头尾相接（5’－3’方向）如果探针和靶序列完全互补，DNA连接酶就会将两探针通过磷酸二酯键共价连接起来如果探针相邻之处有一个碱基不匹配，则连接效率大大降低，即连接阻遏2-2寡核苷酸连接实验1）原理:需要3个探针一个通用探针（它可与靶基因完全互补杂交）一个针对正常序列的探针（只与正常序列匹配、结合）一个针对突变序列的探针（只与突变序列匹配、结合）通用探针+与上述2种探针在连接酶的作用下，头尾相接，形成长链（2个探针长度之和）野生型等位基因的DNA变性为单链DNA，等位基因特异探针和通用探针分别与之杂交（1）野生型等位基因特异探针和通用探针能够与正常靶序列完全互补，然后连接酶将它们连接成一条长链（2）突变型等位基因探针与正常靶序列无法完全互补，因此连接酶不能将它与通用探针连接，故仅短链（3）如果2个探针的反应体系都出现连接反应产物（长链），说明什么？通用探针（AGAT）野生型等位基因特异探针(ATTGA)突变型等位基因特异探针(ATTGG)20bp40bp通用探针野生型者野生型者杂合子2-2寡核苷酸连接实验1）原理常用连接酶是T4DNA连接酶和TthDNA连接酶如果采用耐热的连接酶，则：（1）变性、复性和连接可以循环进行，连接产物呈线性增长（2）同时，杂交的严格度也因杂交温度提高而提高，检测特异性得以提高2-2寡核苷酸连接实验2）应用直接检测靶序列欲提高检测灵敏度时，也可先扩增靶序列目前OLA被广泛用于多种遗传病及常见病的分子检测遗传病病因α1－抗胰蛋白酶缺乏症Aspartylglycosaminuria（AGU）β－地中海贫血症镰状细胞贫血症芬兰型先天性肾病综合征囊性纤维性病变家族性高胆固醇血症遗传性血色病婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积病中链脂酰辅酶A脱氢酶缺乏症甾体21位羟化酶缺乏症缺乏α1－抗胰蛋白酶活性缺乏糖基天门冬酰胺酶活性β－球蛋白合成减少红细胞变形膜蛋白缺乏氯离子转运缺陷低密度脂蛋白（LDL）受体功能受损或缺乏载脂蛋白B100铁代谢缺陷缺乏棕榈酰蛋白硫酯酶活性脂肪酸氧化功能紊乱氢化可的松和醛固酮合成缺陷应用PCR-OLA进行分子检测的遗传病优点:（1）PCR-OLA检测的特异性高，影响因素少，不容易产生假阴性和假阳性（2）利用耐热连接酶可循环进行连接反应，以使信号得到放大，进一步增强灵敏度（3）PCR-OLA可一次检测多个变异（位于一或几个等位基因内）3）方法学评价2-2寡核苷酸连接实验3）方法学评价缺点（1）最大缺点就是整个实验过程需要多相参与（2）需要PCR扩增以达到检测限，限制了该方法的规模（3）多重PCR易产生非特异产物，致其重现性不够2-3温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)1）基本原理（1）DNA的Tm值有序列依赖性，故在一定温度时其解链的程度由Tm决定（2）DNA的突变会改变其Tm值（3）TGGE时：不同Tm值的分子将在不同温度的凝胶位置发生解链（4）部分解链后呈复杂分枝构象的DNA分子的迁移率明显降低，终致不同分子在凝胶的不同位置形成条带2）PCR产物突变的检测原理（1）杂合子的PCR产物中含有四种双链分子两种同源双链DNA分子：wt1/wt2，mt1/mt2两种为异源双链分子：wt1/mt2，mt1/wt2Wt:wildtype;mt:mutanttypewt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/wt2)wt2:TAACCGGTCAATGGTAAmt1:ATTGGCAAGTTACCATT(mt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAwt1:ATTGGCCAGTTACCATT(wt1/mt2)mt2:TAACCGTTCAATGGTAAmt1:ATTGGCAAGTTACCATT(mt1/wt2)wt2:TAACCGGTCAATGGTAAC2）PCR产物突变的检测原理（2）2个同源双链分子由于序列不同，分子的Tm值不同，其解链速度和迁移率不同，从而形成不同的条带，但是，其相对位置不定，取决于变异对Tm值的影响：上还是下调（3）异源双链分子由于含有错配碱基和突出结构，致含有该突变的“解链区域”的Tm值显著降低，电泳时，其位置总是位于同源分子之上TGGE突变检测原理正常人：3和4，只有野生型等位基因（wt/wt,d）突变纯合子：2，只有变异等位基因的同源双链带（mt/mt,c）杂合子：1、5和6（除d外，还有c及异源双链带（wt/mt,a和mt/wt,b）2-4变性梯度凝胶电泳(denaturing-gradientgelelectrophoresis,DGGE)1）原理：20世纪80年代初诞生双链DNA在变性因素线性增加的梯度凝胶中电泳的一种实验，其变性方式：加热（常恒定在60℃）和固定比率的甲酰胺（0－40％）、尿素（0－7M）这些梯度变性的作用相当于TGGE中的温度梯度的作用，使不同DNA在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA分子分离2）DGGE法分析PCR产物的特点（1）如突变发生在最先解链的DNA区，检出率可达100％***为提高其检出率，可人为地加入一个高熔点区——GC夹GCclamp：就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使突变区Tm处于相对低水平而先解链，此举可提高检出率至近100%（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段（3）不需同位素掺入（4）操作简便、快速（24小时内）（5）重复性好但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵DGGE/TGGE的方法学评价**均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选**目前主要用于检测基因突变所致疾病，尤其是只有一个等位基因突变引起的疾病因为杂合子比纯合子多3条带，很容易相互区分DGGE/TGGE方法学评价优点：*检测已知突变的灵敏度都接近100％*适合于检测突变频率在50％以下的稀有变异缺点：只能检测较低Tm的“解链区域”中的突变。为什么？基因突变频率：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值**一个DNA分子中有几个解链区**各个解链区有不同的Tm值**一旦温度到达最低Tm值解链区的Tm，则该分子就形成部分双链的分枝结构，其电泳迁移率急剧降低，致该分子很难“跑”到远处的高温度区。因此，如果变异在高Tm区，就难以检测**同时，较高温度解链的区一旦解链，常常导致DNA分子的完全解链，成单链分子，而小的变异对单链分子之间的电泳迁移率的影响不大2-5变性高效液相色谱法(DHPLC)是目前最灵敏的检测基因变异的方法&灵敏、自动化、高通量，并可检测各种类型的突变&2-5分钟可以检测出1.5kb的分子中的单核苷酸替代、小片段缺失或插入等基因变异&广泛用于人类疾病的基因突变检测及SNP的筛查(1)DHPLC的分离系统@@固定相：柱填料（电中性、疏水性）==惰性物（碳-18烷烃链）+聚苯乙烯-二乙烯基苯（无孔微球体)@@桥分子：既有疏水性又带正电荷的TEAA，是DNA片段与填料之间的桥分子@@流动相：不同浓度的有机溶剂乙腈，逐步洗脱不同