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Chapter5功能基因组学主要研究技术功能基因组学（functionalgenomics）是利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。功能基因组学的研究涉及众多的新技术，包括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因和基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组学技术、反义核酸技术等技术。一、生物芯片的概念生物芯片（biochip）是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。生物芯片计算机芯片二、生物芯片技术产生背景20世纪90年代初开始实施的人类基因组计划（HGP）取得了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了10多种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因序列数据正在以前所未有的速度膨胀。一个现实的科学问题摆到了人们面前：如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能？如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类生老病死的一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术—生物芯片技术，随着人类基因组研究的进展应运而生了。三、生物芯片分类生物芯片DNA芯片蛋白质芯片芯片实验室基因芯片（Genechip)。基因芯片是最重要的一种生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸分子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。蛋白芯片（Proteinchip）。蛋白质芯片是可以在一个非常小的几何尺度的表面积上，集成多种蛋白质活性分子（配基）。仅用微量的生物（生理）的采样即可以同时检测和研究不同的分子、生物分子之间的相互作用以及基因功能的表达，获得各种条件下蛋白质组的条件变化，从而可以获得生命活动的规律。芯片实验室（Lab-on-a-chip）。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品制备、生化反应以及检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。例如可以将样品制备和PCR扩增反应同时在一块小小的芯片上完成。四、基因芯片制作与应用美国AFFYMETRIX公司的一些产品1989年的第一张芯片，构建在显微镜镜片上2002年的全人类基因组芯片，包含33000多个基因位点Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray一）基因芯片发展历史试样处理点阵固定洗涤检测扫描光刻合成微量点样喷墨纯化、标记光化学检测电化学检测二）基因芯片的特点高度集约大通量平行分析高灵敏度样品需要量小技术操作简单自动化程度高应用范围广成本相对较低微板型集成电路型玻片型三）基因芯片的制备固相介质：有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。靶片段：DNA、寡核苷酸、RNA等。探针：mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。标记物：常采用荧光剂，如Cy3、Cy5，同位素、地高辛等。示例：原位喷印合成基因芯片芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。接触式和非接触式直接点样芯片直接打印时针头与芯片接触喷印时针头与芯片保持一定距离四）基因芯片的主要应用单核苷酸多态性（SNP）的鉴定基因表达分析寻找新基因大规模DNA测序疾病的诊断与治疗个体化医疗药物筛选及毒理学研究1、单核苷酸多态性（SNP）的鉴定Chee等（Science，1996，274：610～613）应用包含135000种探针（25mer）的基因芯片，检测了16.6kb的人类线粒体基因组中的SNP位点，从10个样品中，检测出多达505个SNP标志位点。Science25October1996:Vol.274.no.5287,pp.610-614Title：AccessingGeneticInformationwithHigh-DensityDNAArraysAuthors:MarkChee,RobertYang,EarlHubbell,AnthonyBerno,XiaohuaC.Huang,DavidStern,JimWinkler,DavidJ.Lockhart,MacdonaldS.Morris,StephenP.A.FodorAbstract:Rapidaccesstogeneticinformationiscentraltotherevolutiontakingplaceinmoleculargenetics.Thesimultaneousanalysisoftheentirehumanmitochondrialgenomeisdescribedhere.DNAarrayscontainingupto135,000probescomplementarytothe16.6-kilobasehumanmitochondrialgenomeweregeneratedbylight-directedchemicalsynthesis.Atwo-colorlabelingschemewasdevelopedthatallowssimultaneouscomparisonofapolymorphictargettoareferenceDNAorRNA.Completehybridizationpatternswererevealedinamatterofminutes.Sequencepolymorphismsweredetectedwithsingle-baseresolutionandunprecedentedefficiency.Themethodsdescribedaregenericandcanbeusedtoaddressavarietyofquestionsinmoleculargeneticsincludinggeneexpression,geneticlinkage,andgeneticvariability.2、基因表达分析用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列（其中14个为完全序列，31个为EST），检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异，而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。3、寻找新的基因示例：肿瘤相关新基因的发现4、大规模DNA测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Markchee等用含135000个寡核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列，准确率达99%。5、疾病的诊断与治疗从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司，把p53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成p53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用。目前主要涉及的疾病癌症、心血管疾病、血液病、遗传性疾病、神经系统疾病、部分感染性疾病、免疫反应相关性疾病毒物引起的损伤等。6、个体化治疗临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单核苷酸多态性），导致对药物产生不同的反应。如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再开处方，就可对病人实施个体优化治疗。在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异的，用药也应因人而异。例如乙肝有较多亚型，HBV基因的多个位点如S、P及C基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。如将这些基因突变部位的全部序列构建为DNA芯片，则可快速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后有很大的意义。7、药物筛选及毒理学研究在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（highthroughoutscreening），可使新药开发获得技术上的突破。七）基因芯片的发展方向减小实验误差，提高精确度，降低成本基因芯片技术的工业化基因芯片的数据处理基因芯片和组织芯片、细胞芯片等其他类型芯片的有机结合八）应用前景及市场展望前景：生物芯片的成熟和应用一方面将为本世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为未来生物信息学研究中的一个重要信息采集和处理平台。市场展望关于生物芯片的市场状况，到2001年，全世界生物芯片的市场已达170亿美元，用生物芯片进行药理遗传学和药理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约1800亿美元。在最近的5年之内，应用生物芯片的市场销售将达到200亿美元左右。根据专家统计：全球目前生物芯片工业产值最近5年的市场销售可达到200亿美元以上。到2010年，仅美国用于基因组研究的芯片销售额将达400亿美元。这还不包括用于疾病预防及诊治及其它领域中的基因芯片，这部分预计比基因组研究用量还要大上百倍。因此，基因芯片及相关产品产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪最大的产业。一、转基因技术(Transgenictechnology)转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因或DNA导入到