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新生物制品审批办法（局令第3号）【废止】1999年04月22日发布附件九：人基因治疗申报临床试验指导原则1993年5月卫生部公布《人的体细胞治疗及基因治疗临床研究质控要点》以后，国内外基因治疗的临床前及临床研究进展很快。为了我国基因治疗的正常开展管理，特起草本指导原则，作为申报人基因治疗临床试验的试行办法。凡国内单位以及国外单位或中外合资单位所研制的人基因治疗制剂在我国境内进行临床研究，均须按本指导原则进行申报和审批。Ⅰ引言基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于非生殖细胞。基因治疗的申报范围，是将外源基因或遗传物质导入人体细胞以达到防治疾病的目的，不包括应用化学药物改变基因表达。后者应纳入化学药物治疗的申报范围。基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为离体基因导入后进入体内（exvivo）及体内导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入细胞，然后将细胞导入人体；后者则是将基因通过适当的导入系统直接用于人体。所用导入系统包括病毒与非病毒型。因此，申报资料不可能用一个模式来概括，必须按方案及其技术路线而异。本指导原则只可能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定具体申报的内容。根据国内外基因治疗的进展，基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险性，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。为此，希申请者加强咨询和论证，提出一个确保安全有效而又适合实际的申报资料。同时，对每个方案中各个阶段的操作过程、中间及最终制品的制备，务必制订标准操作规程，并予严格实施。Ⅱ申报资料内容一、基因治疗制剂简介（一）申请表（见附表）（二）国内外研究现状、立题依据和目的及预期效果：1.应提供国内及国外已开展的同样或同类疗法的资料，包括所选择的病种、有效性、安全性及必要性。须着重指出申请方案与国外或国内已批准的方案的不同处、特点及其优越之处。凡属新的方案，应说明其优越性及安全性的依据。2.须说明可能出现的副作用或危害，并提出如何避免和减少其危害性或副作用的措施。3.利弊的权衡。根据该治疗方案可能达到的疗效及可能出现的风险，提出总体的利弊权衡的估价。这种估价将是该方案能否获得批准的重要依据之一。（三）制剂的制备工艺简介：简要说明该制剂（或产品）的制备工艺流程及其对安全性的保证。二、基因治疗制剂的性质、制备工艺及质控（一）治疗用的目的基因及其质粒的组建：不论何种导入形式，首先应说明基因治疗所用的目的基因及其来源（尤其是有否涉及国内外专利问题，应有专利查询资料）、分离的材料方法、克隆步骤、DNA序列分析结果以及重组体质粒组建详细步骤及鉴定结果。（二）基因导入系统的组建：这是指将目的基因导入细胞的系统，包括病毒型与非病毒型系统。病毒型导入系统包括逆转录病毒载体、腺病毒载体物质、腺相关病毒载体等。非病毒型导入系统除裸DNA外，一般包括两个部分：一是哺乳动物细胞表达载体；二是其它载体物质，如脂质体、多肽或金属粒子等。为此，需说明目的基因导入系统的性质与内容。1.病毒型基因导入系统：（1）病毒载体及目的基因重组载体a.载体的来源、结构及专利查询资料包括载体DNA的限制性内切酶图谱。若有特殊的元件，如启动子、增强子及PolyA位点等，应提供详细资料。若有改变结构（如丢失片段或插入片段），须提供DNA测序结果。若属新的或改变结构的病毒载体，须提供组建的材料、方法、组建步骤及鉴定结果的全部资料。b.目的基因的重组载体：须包括目的基因的来源、分离方法及步骤以及DNA测序结果，并须说明目的基因的重组载体的组建方法、包括插入的步骤、限制性内切酶图谱。c.目的基因的稳定性：包括目的基因的重组体结构与表达水平的稳定性资料。（2）包装细胞及产病毒的种子细胞库的建立：a.包装细胞：来源、传代历史以及质控的材料。包括细胞形态学、染色体组型、支原体、细菌、病毒等外源因子的检测结果。若需用其它辅助病毒，须说明其来源、分离的方法步骤。b.产病毒的种子细胞库的组建：由病毒载体转染包装细胞所组建的能复制并产生病毒的细胞系称为产病毒细胞系，即种子细胞库。该种子细胞库的组建过程必须予以详细说明，包括材料、方法、步骤、细胞系的鉴定。申报材料包括：●细胞形态学●染色体组型●传代次数●病毒滴度的检测，包括检测技术及可靠性的依据●病毒介导目的基因的表达活性●外源因子检测结果●复制型病毒的检测，包括方法、技术可靠性及结果（3）工作细胞库的建立及质控：须说明工作细胞扩增的方法、传代次数、倍增时间、可允许的传代次数（保持同样的病毒滴度及转导基因的活性）及工作细胞库的规模、保存条件并提供以下资料：●细胞的均一性：包括细胞形态学、染色体组型、表型、导入基因的存在状态及其表达。●病毒滴度●转导基因的活性●外源因子检测结果●复制型病毒的检测所有以上的项目在自检的基础上，均须由中国药品生物制品检定所检测或由国家药品监督管理局指定的单位检定。2.非病毒型基因导入系统非病毒型基因导入系统，均需一个能在人体细胞表达目的基因的质粒。除裸露DNA外，还须附加其它的组分进行加工，如脂质体、多肽系统、金属颗粒等。申报的资料须包括：（1）目的基因的表达载体：提供表达载体的来源、专利查询资料。说明载体组建的方法、步骤、限制性内切酶图谱、质粒的元件构成（包括启动子、增强子、polyA位点等）。耐药基因若属耐氨苄青霉素基因，必须说明使用该基因的原因及以后采取确保安全性的措施。（2）目的基因表达载体工程菌的种子细胞库、工作细胞库的建立，包括上述重组载体转化所用菌种的来源、基因型及表型。种子细胞库的传代次数、质粒拷贝数及基因表达量等。工作细胞库的组建包括扩增条件、传代过程中质粒的稳定性（拷贝数及表达量）、允许的传代次数、细菌的同一性、外源因子（如杂菌、真菌、噬菌体等）的检测等。（3）DNA制备与纯化的工艺。（4）DNA纯度（超螺旋型的含量），细菌基因组DNA、RNA、蛋白残留量及热原质检测结果。（5）若用物理方法导入，须提供其详细方法、步骤，基因导入效率及其表达活性以及导入细胞后基因的稳定性，无重排或突变的证据。（三）治疗用制剂的制备工艺及质控：基因治疗制剂包括直接把病毒或非病毒型基因导入系统作为制剂和通过病毒或非病毒型导入系统，把目的基因导入细胞（同体或异体），而以细胞为最终制剂。对制备工艺及质控必须提供标准操作流程，并按其步骤严格实施。1.病毒型导入系统作为最终制剂：这包括应用逆转录病毒、腺病毒或其它病毒作为目的基因的导入系统，直接用于人体的方案，须提供以下资料：（1）产病毒细胞扩增的步骤，病毒的分离、富集及纯化为制品的全部流程。（2）最终制剂的质控应包括：a.病毒滴度及最终制剂所含病毒量b.病毒介导基因的活性c.复制型病毒的检测d.内毒素检测e.无菌试验f.过敏试验g.异常毒性试验（3）属逆转录病毒的导入系统，应特别注意复制型病毒的检测。检测的范围，包括前述种子细胞库、工作细胞库及最后病毒制品。细胞上清液的取样应相当于培养上清液的5％。细胞须用共培养法，产病毒细胞取样量须达每批中1％。检测方法，须用S+/L-法、标记挽救法或RT／PCR中的两种方法。必须用阳性对照（COS4070A上清液）及阴性对照作严格定量标化，证明其敏感性及可靠性。PCR应利用放射性同位素杂交或同样敏感的系统。（4）若最终制品为腺病毒，须补充以下资料：a.腺病毒颗粒数及感染单位的测定：目前公认的腺病毒的定量，是腺病毒颗粒测定，以腺病毒基因组DNA定量为依据，以1个OD260单位作为1.1×1012颗粒；同时要测定感染滴度。b.复制型腺病毒的检测参考美国FDA1996的建议，在一个病人用的腺病毒的总量中，复制病毒不超过1个PFU。在整个制备过程中，从种子细胞库、工作细胞库的建立以及以后制备用于临床的病毒制剂，均需检测复制性腺病毒。检测必须有阳性对照，感染分子比率（MOI）在10～100之间（过高MOI可抑制复制性病毒的生长）。2.非病毒型导入系统作为最终制剂：这包括表达质粒DNA的直接导入或制备成脂质体、多肽／DNA复合物或金属粒子通过基因枪导入人体等。凡属此类者须提供以下资料：（1）制备工艺流程应包括几个部分：a.目的基因表达质粒DNA的制备工艺：包括大量扩增、DNA分离、纯化成半成品。b.脂质体多肽或其它介导物质的制备工艺。c.加工为最终制剂（如脂质体、多肽／DNA复合物或其它）的制备工艺。（2）DNA半成品的质控：须包括DNA的纯度、超螺旋体的比例；细菌RNA、基因组DNA及蛋白残留量。DNA制备不得应用氯化铯类化合物。（3）脂质体、多肽类的质控。由于脂质体的形成及多肽类合成过程的随机性，不可能达到一般化学合成物的均一性及纯度，为此应提供不同批号间保证安全有效的可以达到的最大均一性的程度。（4）最终制剂的质控：①须提供最终制剂的均一性的资料，不同批号存在的最大均一性的程度，并通过有效性与安全性试验证明在该均一性的范围内有效与安全的证据。②提供以下检测资料：●无菌试验●热原质试验●过敏试验●异常毒性试验●介导目的基因的活性检测●有害物质残余量的测定3.以基因工程化的细胞为最终制剂：这是指应用病毒型或非病毒型基因导入系统，将目的基因导入细胞（自体或非自体细胞），然后扩增成制品而用于病人。这包括exvivo及其它形式的基因治疗。该类制品应参照《人体细胞治疗申报临床试验指导原则》进行申报，同时须提供以下资料：（1）细胞扩增的全部制备工艺，包括生产流程、所用培养液及其配制方法、细胞收集、洗涤最终制品中所用的保存液配方。（2）半成品（分装前）的质控：a.细胞形态、表面标志、染色体组型及其同一性。b.活细胞比例。c.目的基因存在状态、表达及其稳定性。尤其要说明对基因及其载体导入后是否出现基因“插入性突变”及其观察方法及结果。d.上清液中的细菌、热原质及其它外源因子等。e.上清液中小牛血清蛋白残留量。f.若为释放病毒的细胞，须补充提供：①病毒滴度。②病毒转导基因的活性。③复制型病毒的检测。（3）最终制剂（分装后）的质控：a.冻融后细胞存活数、基因表达或转导基因的活性。b.冻融后细胞上清液（抽样、三批）中的下列检测结果：①无菌试验。②热原质实验。c.冻融后细胞的异常毒性试验。d.若属产病毒细胞，需补充：①病毒滴度。②病毒转导基因活性。e.支原体检查。鉴于某些细胞产品，有效期较短，而有些项目的检查须较长的时间（如支原体），这些试验项目可对每批最终产品作留样检查，而该检测结果将为产品的质控提供完整的资料。若留样检查发现阳性结果，应及时对生产过程作检查，对已发放的产品立即采取措施停止使用。（4）附加物的质控：附加物指细胞培养、制备过程中所用血清、生长因子、抗菌素等。对小牛血清蛋白残留量必须检测。对其它因子须说明去除的过程及效果。若加入细胞因子，应单独作出说明。所有保存液成分应提供其安全性的依据。（四）连续三批基因治疗制剂的原始制造及检定记录（五）中国药品生物制品检定所的检定报告（六）基因治疗制剂的稳定性试验资料：需提供保存条件、保存液配方及至少对三批样品进行稳定性考察的具体数据三、基因治疗的有效性试验在临床试验前，须提供基因治疗申请方案的体外及体内试验有效性的资料。（一）体外试验：须证明该外源基因导入细胞后，能表达并能达到治疗效果的依据。若属exvivo，须提供该细胞中目的基因的表达量及细胞导人体内后预期的效果。（二）体内试验：提供动物实验结果证明在体内靶组织中基因导入的效率、表达状态及可达到治疗的目的。动物种类根据实验模型的需要而定。导入的途径应尽可能接近于临床试验的途径或条件。由于小动物对某些途径（如动脉插管）有一定困难，若改变导入途径须说明原因及依据。若有些方案在动物中难以观察其疗效（如种族差异），应充分提供有效性的间接或旁证资料或依据。四、基因治疗的安全性试验：对质控合格的基因治疗制剂，须提供以下安全性试验的资料：（一）总体安全性评估：除了在质控中已规定的各项