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Chapter3DNA’sstructureAntiparallel反向平行strandsofthedoublehelixareorganizedinoppositeorientation,sothatthe5′endofonestrandisalignedwiththe3′endoftheotherstrand.Basepairing碱基配对describesthespecific(complementary)interactionsofadenine腺嘌呤withthymine胸腺嘧啶orofcytosine胞嘧啶withguanine鸟嘌呤inaDNAdoublehelix(theformerisreplacedbyadeninewithuracil尿嘧啶indoublehelicalRNA).Complementary互补basepairs碱基对aredefinedbythepairingreactionsindoublehelicalnucleicacids(AwithTinDNAorwithUinRNA,andCwithG).Supercoiling超螺旋describesthecoilingofaclosedduplexDNAinspacesothatitcrossesoveritsownaxis.DNAisadoublehelix双螺旋3.1DNA的一级结构•定义：核苷酸排列顺序，或称碱基排列顺序。•5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’•3’-TAGCCGATTCCGAGGCTGCT--5’•人类基因组计划――20世纪生物学最宏伟计划：人类基因组的作图与测序。人类基因组计划（1990-2005）；计划耗资30亿美元。人类基因组有30亿碱基对的测序。Apolynucleotide多(聚)核苷酸chainconsistsofaseriesof5￠-3￠sugar异戊糖（环形五碳糖）-phosphate磷酸脂基linksthatformabackbonefromwhichthebasesprotrude•碱基与糖的结合物称为核苷，如果再与一个磷酸脂基相连则形成核苷酸nucleotideacid•核苷酸•嘧啶•嘌呤核苷nucleotide胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键核苷酸nucleotide•核苷酸是核苷的磷酸酯。作为DNA或RNA结构单元的核苷酸分别是5′-磷酸-脱氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷。OBOHOHOH2CPOHHOOB=腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺密啶核糖核苷酸OH2CPOHHOOOBOH脱氧核糖核苷酸•由脱氧核糖和磷酸构成DNA主链（或骨架），其结构单元（由脱氧核糖和磷酸构成）是彼此相同的。对各种DNA一级结构而言，相互间的差别主要是在于所含的碱基的组成、数量及排列顺序上。因此，在描述DNA的一级结构时，总是以其所含碱基的序列为准，并用碱基的第一个英文字母构成的字符串来表示。如：5’dACGTCCTATTCGGT……3’PP5'3'3'5'PP5'3'P5'ACGTThedoublehelixmaintainsaconstantwidthbecausepurines嘌呤alwaysfacepyrimidines嘧啶inthecomplementaryA-TandG-Cbasepairs.ThesequenceinthefigureisT-A,C-G,A-T,G-C.•DNA的一级结构涉及脱氧核糖核苷酸的种类、数量、排列位置和键连接关系•DNA分子在一级结构层次上是由许多脱氧核苷酸分子连接而成的多聚脱氧核苷酸长链分子，通常将链短者称为脱氧寡核苷酸（deoxyoligonucleotide）•在DNA分子中，脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接起来的。•多数DNA是线型分子，也有少数是环形分子。当线型多聚脱氧核糖核苷酸链的3’端羟基与其5’端的磷酸残基缩合成酯后（即形成磷酸二酯键二连接起来），成为环形的DNA。•快速而精确的测定合分析核酸的一级结构，是核酸研究的一项关键技术。目前应用的2种DNA序列测定技术是Sanger等提出的酶法（Sangermethod）合Maxam和Gilbert提出的化学降解法（Maxam－Gilbertmethod）Sanger双脱氧链终止法•DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核酸链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。•具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。Maxam－GilbertDNA化学降解法•该方法的基本步骤为•(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P）•(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰•(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链•(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开•(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。•在这两种方法中，利用化学降解法进行DNA测序具有较高的重现性，而且也容易为一般研究人员所掌握。它的明显优点是其所测定的序列是来自DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用化学降解法可对合成寡核苷酸进行直接测序，可以分析注入甲基化等DNA修饰的情况。还可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及DNA－蛋白质相互作用。•Sanger的酶法则需要有单链模板和特异的寡核苷酸引物，而且还需要高质量的聚合物制剂。因其简便快速，仍然被广泛的应用。•DNA一级结构是DNA结构层次中的基础层次，不仅是认识和研究二级结构和三级结构的基础，同时是进一步分析DNA结构－功能关系的前提，而且有利于基因表达、调节和控制等多项分子生物学的研究。3.2DNA的二级结构•即双螺旋结构。受环境因素,如平衡离子类型、离子强度、特异结合蛋白、水合状态等的影响,以及DNA分子碱基的组成都可促使DNA分子取不同的构象。•DNA分子存在多种构象•㈠B型结构:（右手双螺旋）这是水溶液（或相对湿度92%以上）中的主要构象。•㈡A型结构：相对湿度75%，矮胖型，直径大。•㈢Z型结构：Wang等人在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射图谱发现主链呈锯齿排列。DNA的双螺旋结构•不同物种DNA中各种碱基的含量不同，这个结果启发人们：碱基序列正是遗传信息的载体形式•到二十世纪五十年代，遗传信息的概念已经被人们广泛的认同，但同时也提出了两个新的课题•一个是DNA的结构•另一个是碱基序列是如何编码蛋白质的氨基酸序列的三个方面的发现•1953年，基于三个方面的发现，Watson和Crick提出了双螺旋模型：•*X光衍射实验数据表明DNA是一种规则螺旋结构：每3.4nm旋转一周，直径约为2nm。因为相邻核苷酸距离为0.34nm，因此每圈有10个核苷酸单位。•*DNA密度测量说明这种螺旋结构应有两条链。这样如果两条链间的碱基都是朝里而且严格的按嘌呤对嘧啶排列，螺旋直径保持不变就很容易解释，否则，嘌呤对嘌呤则太粗，嘧啶对嘧啶则太细。•*不论碱基数目多少，G的含量总是与C一样，而A与T也是一样。因此通常以G+C的含量来描述DNA的组成。不同物种G+C的含量一般在26~74%。•DNA中两条核苷酸链是以碱基间的氢键相连的•在通常状况下，G只与C特异性的以氢键相接，而A则只与T相作用。这种反应称之为碱基互补反应，而配对的碱基则被称之为互补（A与T，G与C）•在这种模型中，两条核苷酸链是反向的（反平行），沿着螺旋旋转方向，一条是5’-3’方向，而另一条是3’-5’方向。•糖基-磷酸脂基构成的主链暴露在外表面，并带有磷酸脂基的负电荷。当DNA处于体外溶液时，电荷被一些能与之结合的金属离子，一般是Na+，所中和；而在活体内，则是由带正电荷的蛋白质提供中和电荷。这些蛋白质在决定DNA的内型上起着很重要的作用。碱基处于双螺旋结构的内部，平面结构，垂直于螺旋轴成对排列。•双螺旋体类似于盘旋的楼梯：碱基对如同踏板，顺着螺旋，碱基一个堆一个，像一叠盘子。ThetwostrandsofDNAformadoublehelix.Basepairsfillthecenterofthehelix;thephosphates()areontheoutside.TheB-formDNAhelixhasadiameterofabout20Å~20ÅAbasepairismoreexposedtothesolventononeside(the“majorgroove”,atthetopintheseviews)thantheother(the“minorgroove”,bottom).B-formDNAconsistsofaright-handeddoublehelixwithantiparallelstrands34Å(10bp)perturnmajorgrooveminorgroovemajorgrooveminor3.4ÅperbpThesedimensionsareforDNAfibers.Insolution,thereare~10.5base-pairsperturn.5’3’5’3’•湿度影响DNA的结构。脱水会使B型转换成A型。生理状态下，dsRNA和RNA:DNA杂交体都为A型。A型缺乏柔韧性，比B型难融解。在体内B-DNA占绝大多数。A型和B型的重复单位都是一个碱基对，而Z型为2个碱基对，一般为嘌呤和嘧啶交替组成，如oligo-dGdC,oligo-dAdT等。•B-DNA:B-DNA的钠盐结构是由两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构。多核苷酸的方向由核苷酸间的磷酸二酯键的走向决定，一条从5’-3’，另一条从3’-5’。链间形成一条较浅的小沟和一条较深的大沟。两条链上的碱基以氢键相连，G与C配对，A与T配对。双螺旋的中心轴与碱基平面垂直，并穿过氢键的中点。相邻碱基对平面间的距离为0.34nm，绕螺旋轴旋转约36度。这样约10个碱基对旋转一周。碱基对层叠于双螺旋的内侧，磷酸与脱氢核糖在外侧。脱氧核糖环平面与双螺旋的中心轴大致平行。双螺旋的直径为2.0nm•C-DNA是在特定的盐和湿度（相对湿度44％-66％）条件下A型和B型之间的中间产物，属于B族DNA•D-DNA也是B族DNA的一员。天然DNA一般不采取D型双螺旋结构。但是当DNA中有A,T顺序交替的富含AT区域，可能采取D型。Z-型DNA构象的主要特征•糖-磷酸主链的走向呈之字形,分子呈左手螺旋构象，每一螺圈含12对碱基,距离为4.46nm。•糖环折叠不同于A或B型DNA,鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈顺式构型,而嘧啶碱基仍是反式构型•Z-DNA仅有一条小沟,且较深,含有较高的负电荷密度•Z-DNA较B-DNA细而“舒展”,螺旋直径为1.8nm。•维系DNA二级结构的主要作用力是氢键和碱基堆集力,而磷酸基的负电荷和碱基内能则不利于双螺旋结构的稳定•在生理状况下,双螺旋的碱基对之间氢键不断地发生断裂和再生,这就是DNA的所谓呼吸作用•DNA在热或其他变性剂作用之下,双链发生分离,即变性作用。变性的DNA单链在适合的条件下又能恢复双螺旋结构,即复性作用。基于DNA的变性作用和复性作用,产生了十分有用的分子杂交技术。DNA二级结构的其他构象•反向重复序列:在同一多核苷酸链内的相反方