1第六章菌种筛选

第六章菌种的筛选与保藏简介微生物本身或其代谢过程中产生的众多的代谢产物，其中许多是对人类有应用价值的。获得发酵工业中的生产菌种的方法有——索取或购买，从自然界中分离筛选，对原由的菌种进行遗传改造。第一节从自然界中分离菌种一、筛菌的一般步骤：设计方案采样增殖培养*平板分离筛选(初筛、复筛)单株纯种分离性能考察(生性能试验、毒性试验、菌种鉴定）•每一步骤的目的•可以省略的是哪一步？（一）采样：采集含菌的样品采样中应考虑的几个问题土壤中有机物的含量采样的深度离地表5--20cm处的土壤植被情况采土的季节以春、秋两季为宜采土样的方法选好适当的地点后，用小铲子除去表土，取5--20cm处的土样几十克，盛入事先灭过菌的防水的袋中，并在上记录采土时间、地点和植被情况。采好的土样应尽快分离。（二）增殖培养（富集培养）利用选择性培养基的原理，在土样中加入某些特殊的营养物，创造一些有利与待分离对象生长的条件，使其大量繁殖，从而有利于分离它们。也可以通过控制培养条件，达到富集的目的。提高样品中目的菌所占比例例如:在土样中加入纤维素，可以富集纤维素分解菌。增殖培养的方法控制培养基的营养成分控制培养基的pH控制培养的温度热处理添加抑制剂•这些方法的适用范围芽孢杆菌经热处理的土样无pH7.0通空气乳酸细菌植物材料牛奶葡萄糖20pH6.5无空气肠道细菌土样或污水样葡萄糖20，CaCO320pH7.0有或无空气发酵糖梭菌经热处理的土样葡萄糖20，CaCO320pH7.0无空气丙酸细菌瑞士干酪酪氨酸20pH7.0无空气增殖微生物类别分离的样品培养基外添加物（克/升）控制的环境条件醋酸细菌果汁、啤酒发酵醪乙醇40pH6.0通空气增殖培养的举例抑制不需要的菌类（三）纯种分离将目的菌从混杂的群体中分离出来，获得纯培养。菌株纯——一般纯种分离方法细胞纯——小滴分离法、显微操纵器进行分离。纯种分离的一般方法稀释分离法划线分离法组织培养法——适用于分离高等真菌和植物病原菌。纯种分离的方法:稀释分离倾注平板涂布平板划线分离1.接种环灭菌2.从琼脂平板(A)或培养液中取培养物3.划线分离平板反应快速检出法•根据分离培养基上的特异反应来挑选目的菌的一种快速、简捷的方法。•与样品纯种分离同时进行•检测单菌落是否产目的产物，并对目的产物量进行粗略的估计平皿反应快速检出法•纸片培养显色法•透明圈法•变色圈法•生长圈法•抑菌圈法（1）纸片培养显色法滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基用接种环接种保湿恒温培养据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法碳酸钙平板透明圈：产酸（3）变色圈法淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶葡聚糖加刚果红平板：葡聚糖酶木聚糖加刚果红平板：木聚糖酶橄榄油加罗丹明B平板：脂肪酶平板检测脂肪酶活性（4）生长圈法适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育工具菌：营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物菌落形态明显不同于目的菌方法：106~107工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌（5）抑制圈适用：抗生素产生菌的选育工具菌：对目的抗生素敏感的微生物例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器（6mm）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低琼脂块培养法筛选抗生素产生菌程序(四)筛选•对分离获得的纯培养菌株进行生产性能的测定，从中选出适合生产要求的菌株。•精确的性能测定——定量分析筛选为什么要分为初筛和复筛进行？两者的区别筛选条件如何确定初筛和复筛的比较初筛复筛种子斜面菌种液体种子摇瓶每株1瓶每株3-5瓶接种量每瓶一环3—5%取舍情况留下产量较高的10--20%的菌株每次保留10—20%，直至最后3—5株五.培养工艺条件试验与生产实验•对获得的优良菌株进行全面的培养工艺条件试验•获得某菌株的优化培养工艺条件摇瓶发酵条件：培养基的组成、初始pH值、通风量、接种量、培养温度、培养时间等•小型台式发酵罐中进行优化•将试验规模放大到中试、大型发酵罐生产试验的水平•菌种鉴定——常规鉴定、分子鉴定好氧培养（摇瓶发酵）举例：产淀粉酶芽孢杆菌的分离筛选采样地点的选择增殖培养的方法纯种分离平板快速检测法筛选性能考察保藏台酚蓝平板上的透明圈举例产蛋白酶芽孢杆菌的分离筛选采样地点的选择增殖培养的方法纯种分离平板快速检测法筛选性能考察保藏二、厌氧菌的培养法去除培养基中的溶解氧，降低Eh值煮沸法培养基中加入还原剂还要加入刃天青指示氧化还原电位创造无氧的环境物理学方法；化学方法生物学方法；混合法主要是通过除氧、耗氧的方法除去体系中的氧常用的厌氧培养法•高层琼脂柱，穿刺培养•厌氧培养皿•亨盖特滚管技术•厌氧灌技术•厌氧手套箱Hungate滚管厌氧培养装置GasPak厌氧手套箱第二节.菌种的保藏菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是一项重要的微生物学基础工作。在生物进化的长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性是相对的。退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。一、菌种的退化（一）菌种退化的现象•菌种退化是由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。•注意区分有环境条件改变造成形态和生理上的暂时改变；以及杂菌污染情况。1.菌种退化的表现生产形状的劣化，遗传标记的丢失，原有的典型形状的不典型等。菌落及细胞形态的改变生长速率减缓，产孢量减少代谢产物的生产能力下降——负突变致病菌对宿主侵染能力的下降抗不良环境条件能力的减弱等(二)退化的防止1.控制传代次数2.创造良好的培养条件3.利用不易退化的细胞传代4.采用有效的菌种保藏方法二.菌种的保藏目的妥善保藏菌种，使其原来性状和活力不退化，不死亡，不被污染，以达到便于研究、交换和使用的目的。（一）菌种保藏的原理根据微生物的生理、生化特点，人工地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。生活态——传代培养保藏法连续在培养基上(内)移种连续在活细胞上(内)移种休眠态干法——保藏在玻璃管内，封入安培管；——吸附在适合的载体上，砂粒等湿法——保藏在固体斜面、液体介质中措施低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促反应温度低限-140℃干燥缺氧避光缺乏营养添加保护剂甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白添加酸度中和剂常用的菌种保藏方法斜面保藏法石蜡油封藏法砂土管保藏法冷冻干燥保藏法甘油悬液低温冷冻保藏法液氮超低温保藏法（二）菌种保藏方法1、斜面保藏法：方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏措施：低温：4℃适用：各大类保藏期：1~6个月用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间2、甘油悬液保藏法：方法:培养好的微生物细胞加15~30%甘油缓冲液→装入保藏管中→放入-70℃冰箱措施：低温、保护剂适用于细菌和酵母等微生物,保藏期5~10年;可以保藏感受态的大肠杆菌3个月。优缺点：3、冷冻干燥保藏:是一种有效的长期保藏菌种的方法方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-40℃或-70℃）→抽真空（至0.01mmHg）→最后熔封管口→至于4℃保藏措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂适用：各大类保藏期：5~15年或更长优缺点:适用的菌种多,保藏期长,存活率高,便于分发等优点设备较贵、操作比较烦琐4、液氮超低温保藏法：方法：微生物细胞混悬于含保护剂的液体培养基中→分装入耐低温的安培管中→缓慢预冷→移至液氮罐中保藏。措施：超低温、有保护剂优缺点适用于各大类微生物、保藏期长（15年以上）需要特殊的设备、操作较复杂、管理费用高和发放不便其它保藏方法石蜡油封藏法方法：斜面或半固体接种→培养→加无菌液蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏措施：低温，隔氧适用：不能利用石油的各大类保藏期：1~2年优点：简便砂土管保藏法方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→保藏措施：无营养，缺氧，干燥适用：产孢子（芽孢）微生物保藏期：1~10年常用的保藏方法比较（三）菌种保藏机构1、中国微生物菌种保藏管理委员会CCCC（ChinaCommitteeforCultureCollectionofMicroorganisms)2009年成立的中国科学院微生物研究所微生物资源中心IM-CAS-BRS，前身是中国普通微生物菌种保藏中心GMCC(归口中国科学院)：目前保藏有3900多种微生物，总数达3.5万株中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会)中国食品发酵工业研究所(IFFI)中国高校工业微生物资源与信息中心(CICM-CU)——江南大学中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院)中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF)中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京卫生部药品生物制品检定所(NICPBP)中国预防医学科学院病毒研究所中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)中国医学科学院医药生物技术研究所四川抗生素研究所(SIA)，四川华北制药厂抗生素研究所(IANP),石家庄中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部)农业部兽药监察研究所(NCIVBP)中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院)中国林业科学院林业研究所(RIF)2、美国典型培养物收藏中心ATCC——AmericanTypeCultureCollection3、美国北部开发利用研究部NRRL4、荷兰霉菌中心保藏所CBS5、英国国家典型菌种保藏所NCTC6、日本大阪发酵研究所IFO设计型实验要求——(实验讲义十一)•自然界中菌种分离筛选的一般步骤子题目：样品中淀粉分解细菌的分离筛选查阅资料、制定相应的实验方案（采集土样的地点、所需的培养基、培养条件等）；每位同学独立完成预习报告；每个小组讨论后，决定本组的实验方案，写出实验预习报告。实验设计过程中应注意的问题•查阅资料•确定分离的目标菌•选择采样的地点；富集的方法和平板快速检测的方法•培养基的设计•统计所需的玻璃器皿的数量1、初筛通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶•目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法2、复筛：每株3-5瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，3-5%接种量，•培养条件可同初筛•分析测定：定量，注意副产物复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株第五章1.在恶劣环境中，微生物会如何？2.极端温度对微生物有何影响？3.菌膜的形成与该菌种的好氧程度有关。4.紫外造成的微生物细胞的损伤主要是什么？5.光复活现象6.微生物的代谢是如何改变环境的pH的？7.灭菌、消毒；两者的不同之处主要有哪些？8.高压蒸汽灭菌与干燥箱干热灭菌在灭菌原理、适用对象、操作及注意事项上有何区别？9.水、空间（空气）的消毒的主要有哪些方法10.实验室和发酵工厂主要的灭菌和消毒措施有哪些？1.兼性厌氧微生物和耐氧厌氧微生物细胞内都含有SOD酶和过氧化氢酶。2.培养基的灭菌条件通常为121℃30分钟，这是因为自然界中最耐热的嗜热脂肪芽孢杆菌的细胞要在121℃,12分钟才能被完全杀死。3.啤酒酿造过程中酵母的生长温度与发酵温度基本上是一致的。1.常用消毒酒精的浓度的事（）①30%②70%③95%④100%2.制备培养基的最常用的凝固剂为（）①硅胶②明胶③琼脂④纤维素3.酵母菌属于（①好氧型②厌氧型③兼性厌氧型④