1细胞样品RNA的抽提逆转录(RT)及实时定量PCR(qPCR)测定

细胞样品RNA的抽提、逆转录(RT)及实时定量PCR（qPCR）测定分子医学教育部重点实验室郭亮2014.04.15•E-mail:[e-mail]•Office:13#511•Tel:[phone]实验目的了解RNA抽提原理熟悉RNA抽提方法掌握RNA操作注意事项了解RT-qPCR的原理熟悉RT-qPCR的方法核酸(nucleicacid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，除了携带和传递遗传信息(DNA)，还发挥许多重要的生物学功能(RNA)。核酸的分类及分布存在于细胞核和线粒体分布于细胞核、细胞质、线粒体(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，并通过复制传递给下一代。是DNA转录的产物，参与和调节遗传信息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体核酸组成DNAandRNA有何不同G,C,A,TG,C,A,U脱氧核糖核苷酸(DNA)核糖核苷酸(RNA)DNAandRNA有何不同DNA:双链，稳定性高，可以保存很久，主要在核内。功能较单一，主要发挥携带遗传信息的作用DNAandRNA有何不同RNA:单链，稳定性差，容易形成二级结构核、胞浆、线粒体、体液等都有，功能广泛。DNAandRNA有何不同双链DNA由于2号位含有氧，使RNA的磷酸二酯键在碱性条件下易受破坏进而断裂。RNADNADNA中的嘧啶RNA中的嘧啶C和U结构类似，一旦发生CU突变,机体的纠错系统不易识别。RNA的量及类型却因细胞种类以及细胞状态的不同而有很大差异DNAandRNA有何不同同一个体的不同细胞中，DNA含量基本相同RNA的种类和功能种类百分比功能mRNA2-5%蛋白质合成模板rRNA80%核糖体组分tRNA15%氨基酸转运其他非编码RNAlncRNA(200nt)..非常复杂：基因沉默、蛋白相互作用等sncRNA(200nt)snRNA..内含子加工剪接ribozyme..RNA剪接修饰siRNA..降解mRNAmiRNA..基因表达调节………DNA是遗传信息的主要携带者而RNA以及蛋白质是遗传信息的主要执行者RNA抽提实验原理抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，常用异硫氰酸胍/酸性酚法(Trizol);细胞在异硫氰酸胍和酚的作用下被裂解，蛋白变性，核酸释放；异硫氰酸胍是RNA酶的强效抑制剂，保护RNA免受降解；加氯仿共抽提，促进有机相和水相分层；释放出来的DNA和RNA由于在PH值5.1的条件下溶解度的不同，分别位于中间层和上层水相；吸取上层水相，将RNA与蛋白质、DNA分离；最后利用异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，即可获得纯化的总RNA。液氮保存，或者加入Trizol-70℃保存保证Trizol过量：1、防止RNA降解；2、以免PH值变中性，造成DNA溶解进入上层的水相；3、影响蛋白质变性的效果，造成蛋白质的污染。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖、盐不产生沉淀。RNA不要晾太干，以免影响后续溶解；溶解RNA的水需经RNA酶抑制剂(DEPC)处理。RNA产物的鉴定RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验；高纯度RNA的A260/A280处于1.9至2.1之间最佳，偏小说明蛋白质污染，偏大说明RNA有部分降解；A260与RNA浓度呈正比，1OD=40μg/mlRNA；RNA的完整性可通过电泳检测RNA为单链分子，二级结构复杂，需先经甲酰胺变性，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。细胞总RNA以rRNA含量最高，电泳时可观察到18S与28SrRNA两条清晰条带，且亮度之比接近1:2，表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8SrRNA与tRNA组成。RNA电泳结果示意图28S18S5SRNA电泳结果凝胶成像图28S18S5S28S18SDNA或者蛋白污染时的电泳情况少说话，戴口罩、手套操作注意事项DEPC是强烈的烷化剂，通过与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶活性，是消除外源性RNA酶的主要方法。但DEPC有致癌作用，并具有很强的反应性，因此注意：使用时，不直接接触DEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后使用。RNA纯化的质量决定了后续实验的成功与否什么是RT-PCR/qPCR包含两个步骤:RT–ReverseTranscription（反转录）以RNA为模板合成单链DNAqPCR–QuantitativePolymerasechainreaction（实时定量PCR）用特异性引物以及荧光染料扩增目的基因，通过荧光信号检测DNA水平PCR–Polymerasechainreaction用特异性引物扩增目的基因，通过DNA凝胶电泳等方式检测DNA水平或者RT-PCR/RT-qPCRAAAAAAAAAAmRNAmRNAReversetranscriptioncDNAPCR/qPCRAmplificationofcDNAforanalysisTTTTTApplicationsofRT-PCR•Cloninggenes’expressedforms(notgenomicversion)•Monitoragene’sexpressionlevelinanytissue•Monitorexpressionchangesfollowingtreatments•sequencingawholemRNAprofile•EST(ExpressedSequenceTags)–database•Microarray(DNAchip)•Diagnoseandeasilydifferentiatebetweendifferentcancertypes•Earlydetectionofhiddenillnesses•etc…分子生物学的中心法则中心法则是绝对的吗？?Isthereawayback???RNA病毒（逆转录病毒）,如T细胞淋巴瘤病毒HTLV－I病毒逆转录酶的发现双链DNA病毒单链DNA病毒•不含DNA•感染动物后可以导致肿瘤•RNA本身无法整合到动物基因组RNA病毒如何导致肿瘤？HowardTeminproposedthatRNAtumorvirusescancausepermanentalterationstocellsbyintegratingintohostchromosomes.RNAsfirsthastobeconvertedintoDNAs,whichcouldthenbecomeintegrated.IfalltheaboveistruethereMUSTbeamechanismtoconvertRNAintoDNA!逆转录酶的发现Twoseparateresearchteams,oneledbyTeminandtheotherbyDavidBaltimore,simultaneouslydiscoveredtheelusiveRNA-copyingDNApolymeraseinpurifiedvirions–aftermanyyearsofpainstakinglaboratorywork.1970:1975:TeminandBaltimoresharedtheNobelPrizeinphysiologyormedicinefortheirdiscoveryofreversetranscriptase.逆转录酶的发现Reversetranscriptaseusesasingle-strandedRNAtemplatetocreateadouble-strandedDNA.copyccc逆转录酶的工作原理逆转录反应–stepbystepAAAAAAAAAAAAAAA65ºC+ice37ºC/42ºCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTReversetranscriptasedATPdCTPdGTPdTTPRNaseinhibitormRNAmRNA1.denatureAAAAATTTTTmRNA2.anneal+elongateTTTTTcDNARTcDNARTRToverAAAAA37ºC/42ºC逆转录反应–引物的选择Randomprimer(随机引物):序列随机的六聚体寡核苷酸，适用于长的或者有发夹结构的RNA.可以在逆转录前，先对RNA样本进行DNA酶处理实验内容：利用RT-qPCR法检测脂肪细胞分化前后PPARγ基因表达的变化3T3-L1脂肪细胞分化模型Day0Day6前脂肪细胞脂肪细胞脂肪细胞分化诱导剂PPARγADIPOCYTEGENESPPARγ是脂肪细胞的标志性基因Day0Day6PPARγSp1PPARγ在脂肪细胞中的表达显著高于前脂肪细胞RT-PCR结果量很少，需要进行PCR扩增，便于检测本次实验课下次实验课实验注意事项•两个同学为一组，协同实验；•记住自己的样品号；•实验分两次课：本次课做RNA抽提、定量和RT，下次课做qPCR；•请按照实验操作步骤（第1、2页）进行实验；•课后请仔细阅读qPCR的实验步骤（第3、4页），下次实验课先进行实验，然后讲解理论。