1血浆蛋白质与含氮化合物的生物化学检验

总课时：64龚晓华52813645332609QQ:836900873血浆蛋白质与含氮化合物的生物化学检验2临床检验教研室龚晓华本章内容概要：第二节氨基酸代谢紊乱的生物化学检验第一节血浆蛋白质的生物化学检验3第三节嘌呤核苷酸代谢紊乱的生物化学检验1、掌握急性时相反应蛋白的概念及临床意义；重要血浆蛋白质的测定方法、参考值和临床意义；嘌呤核苷酸代谢紊乱—高尿酸血症及痛风2、熟悉血清蛋白电泳图谱与异常带型、血浆蛋白质的理化性质和功能3、了解氨基酸代谢紊乱、血清特定蛋白质的检测方法本章教学要求：4第一节血浆蛋白质的生物化学检验机体蛋白质：体液蛋白质的检测：机体主要的生物大分子含量：人体固体成分的45%种类：10万，3000~5000种/单细胞功能：生长，代谢、血凝、运动、免疫、信息传递等疾病发生体液蛋白质异常5要判断异常首先要清楚正常的血浆蛋白质组成，功能，分类及特点一、血浆蛋白质的组成、功能及分类组成：种类：1000种已研究500种已分离200种含量：μgmgg来源：肝脏是蛋白质主要的加工厂6功能：①营养作用，修补组织蛋白;②维持血浆胶体渗透压③作为PH缓冲系统的一部分④作为激素、维生素、脂类、代谢产物、离子、药物等的载体；⑤体液免疫防御系统⑥催化作用⑦代谢调控作用⑧参与凝血与纤维蛋白溶解7分类：依据来源、分离方法和生理功能来源肝生成：绝大多数血浆蛋白质其他组织细胞生成：免疫球蛋白和蛋白类激素8分离方法盐析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半饱和的硫酸铵溶液）电泳法：醋酸纤维素薄膜电泳：6种琼脂糖凝胶电泳：13种聚丙烯酰胺凝胶电泳：30种SDS聚丙烯酰胺凝胶等电双向电泳：300种分辨率增高--+醋酸纤维素薄膜910功能分类:11二、重要的血浆蛋白质和血清蛋白质电泳正常血清蛋白电泳图谱示意图及其扫描曲线12电泳区带蛋白质种类成人参考值（g/L）半寿期（d）分子量（kD）等电点含糖量(%)功能前清蛋白前清蛋白0.2~0.41.9554.70.5营养、运载清蛋白35~5215~1966.24~5.80维持胶压、运载和营养等α1-球蛋白α1-抗胰蛋白酶0.9~2.04524.812蛋白酶抑制剂α1-酸性糖蛋白0.5~1.25402.7~445免疫应答修饰剂甲胎蛋白3×10－569胎儿期蛋白高密度脂蛋白1.7~3.25200胆固醇逆转运α2-球蛋白结合珠蛋白0.3~2.0285~4004.112结合血红蛋白α2-巨球蛋白1.3~3.057205.48蛋白酶抑制剂铜蓝蛋白0.1~0.44.51324.4铁氧化酶β-球蛋白转铁蛋白2.0~3.6779.65.76运铁到胞内低密度脂蛋白0.6~1.55300运胆固醇到组织C30.9~1.81852补体成分C40.1~0.42067补体成分β2-微球蛋白0.001~0.00211.8纤维蛋白原2.0~4.02.53405.53凝血因子γ-球蛋白IgG7.0~1624144~1506~7.33免疫球蛋白IgA0.7~4.06~1608免疫球蛋白IgM0.4~2.3597012免疫球蛋白C-反应蛋白＜5~1156.20炎症介质血浆蛋白质的性质功能及其与电泳区带的关系13图谱类型TPAlbα1α2βγ低蛋白血症型↓↓↓↓N↑N↓N↑肾病型↓↓↓↓N↑↑↑↑↓N↑肝硬化型N↓↑↓↓N↓N↓β-γ↑（融合）弥漫性肝损害型N↓↓↓↑↓↑慢性炎症型↓↑↑↑急性时相反应型N↓N↑↑NM蛋白血症型在α-γ区带中出现M蛋白区带高α2(β)-球蛋白血症型↓↑↑↑妊娠型↓N↓↑↑N蛋白质缺陷型个别区带出现特征性缺乏异常血清蛋白质电泳图谱的分型及其特征14A正常人B肾病综合征C肝硬化(β-γ桥)D肝硬化(不典型β-γ桥)E多发性骨髓瘤IgA型F多发性骨髓瘤IgG型典型异常血清蛋白电泳图谱15正常血清蛋白电泳上显示的宽γ区带主要成分:免疫球蛋白(Ig)。浆细胞病（plasmacelldyscrasia）：异常浆细胞增殖，产生大量单克隆Ig或其轻链或重链片段，病人血清或尿液中可出现结构单一的M蛋白（monoclonalprotein）在蛋白电泳时呈现一个色泽深染的窄区带，此区带较多出现在γ或β区，偶见于α区。浆细胞病与M蛋白16三、急性时相反应蛋白急性的全身或系统性炎症包括感染、组织损伤（如创伤、手术、心肌梗死、恶性肿瘤等）、炎症性疾病（如自身免疫性炎症）等情况下，肝脏对多种血浆蛋白质合成量发生变化，可有明显的升高或降低，这些变化的血浆蛋白质统称为急性时相反应蛋白（APRs），增加的蛋白质称为正向APRs，下降的蛋白质称为负向APRs。17正向APRsCRPPCTSAAAAGAATHpC4Fg(FIB)C3CpPAAlbTRF负向APRs急性时相反应机制：当机体受到损伤或炎症时释放小分子蛋白质导致肝细胞中上述蛋白质的合成增加或减少。急性时相反应的应用：急性时相反应时,血浆蛋白质的变化和创伤的时间进程有关，可用于鉴别急性、亚急性和慢性病理状态。1819四、血浆中几种主要蛋白质（一）血清总蛋白（TP）血清总蛋白是血浆中所有蛋白质含量的总体反映，与肝脏合成蛋白质功能及免疫球蛋白合成情况有关，尤其是结合血清白蛋白浓度，能大概反映免疫球蛋白的含量。参考值成人：65～85g／L201.凯氏定氮法－参考方法2.双缩脲法(最好)3.酚试剂法4.散射比浊法5.染料结合法6.UV法测定方法1.凯氏定氮法－参考标准方法(0.05mgN0.3gpro)消化用浓硫酸将蛋白质消化为硫酸铵；（耗时）蒸馏用碱性溶液碱化消化液并蒸馏挥发；吸收用酸性溶液（硼酸）吸收气态氨（使[H+]）滴定用已标定的无机酸滴（使[H+]恢复），计算总氮量定蛋白（总氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液与氨反应生成淡黄棕色胶态化合物，其色度与氨氮含量成正比。原理：21评价：优点：准确度高，精密度高，灵敏度高，是公认的参考方法。缺点：操作复杂，费时，不适合常规检测，血清各蛋白含氮量会有所变化尤其是疾病时。应用：标准蛋白的标定及校正其它常规方法222.双缩脲法原理：蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性溶液中能与Cu2+作用而产生紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。条件：至少含两个肽键（-CONH-）基团才能和Cu2+形成络合物,氨基酸及二肽无反应,三肽以上才能反应。双缩脲生成加热＋NH322H－180022222N端C端23评价：优点：简便，准确，重复性好，10g-120g/L线性好，特异性与精密度好，批内CV%＜2%，显色稳定。缺点：灵敏度较差，对蛋白质含量低的体液标本不适合。应用：常规推荐方法。手工或上机使用。243.酚试剂法原理：蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物，Lowry改良法：在酚试剂中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的灵敏度，为双缩脲法的100倍左右。25评价及应用：优点：操作简单，改良法灵敏度高（10μg-60μg），适合测定蛋白含量少的标本。缺点：各种蛋白质酪氨酸和色氨酸比例不同，只适合测定单一蛋白质。受一些药物干扰。264.比浊法原理：评价及应用：优点：简便不需特殊仪器。缺点：浊度形成的干扰因素多（加试剂方法，反应温度，蛋白絮状沉淀等）某些酸类（磺基水杨酸等）和血清蛋白质结合产生沉淀，测其浊度，与标准对比，可求蛋白含量。275.染料结合法在酸性环境下，带正电的蛋白质（-NH3+)与染料的阴离子产生颜色反应，使染料的吸收峰改变，可既而用分光光度法比色测定。原理：常用染料：氨基黑，考马斯亮蓝等评价及应用：优点：操作简便，重复性好，灵敏度高，且干扰因素少。缺点：特异性不高；不同蛋白质和染料的结合力不一致，标准物不易确定。286.紫外分光光度法蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm处有一吸收峰。可用于测定蛋白质但需避免核酸干扰。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（2）Warburg-Christian公式蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260原理：29评价及应用：优点：敏感而简便，可保留蛋白生物活性，常用与较纯的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度计及石英比色皿。缺点：各种蛋白质中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm测定易受游离色aa和酪aa以及尿酸和胆红素的干扰；导致准确性和特异性受影响。措施：在220-225nm波长区域，用0.15mol/l的NaCl稀释1000-2000倍可消除干扰。30结构：也称白蛋白，585个aa残基构成的单链多肽，MW=66458，含17个二硫键。理化性质：pI=4－5.8，肝细胞合成但不储存，半衰期为15-19天，占总蛋白的40%－60%，pＨ7.4时带负电。测定方法：色素结合法:溴甲酚绿（BCG），溴甲酚紫（BCP）,盐析等。（二）清蛋白（ALB）急性时相反应蛋白31参考值成人：40～55g／L临床意义：白蛋白升高：白蛋白降低：肝功能下降：慢性肝病白蛋白丢失：由尿中、胃肠道、皮肤丢失白蛋白分解代谢增加：组织损伤及组织分解增加白蛋白分布异常：肝硬化等先天性ALB缺乏病：极少见的遗传性疾病蛋白质营养不良或吸收不良的评价指标真性升高：未见假性升高：机体明显失水，或治疗输入过多白蛋白3233＞35g/L正常28～34g/L轻度缺乏21～27g/L中度缺乏＜21g/L严重缺乏低于28g/L时会出现组织水肿血浆Alb作为营养指标的评价标准方法：间接法:TP-ALB=GLB直接法:乙醛酸比色法(GLB中的色氨酸远大于ALB中的色氨酸含量)色氨酸+乙醛酸紫色化合物H+Hopkins-Cole反应:成人20－40g/L.A/G：1.2－2.434球蛋白（GLB）参考值临床意义：球蛋白升高：球蛋白降低：合成减少、低或无γ-球蛋白血症真性升高（常见）：自身免疫性疾病、感染反应、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症。假性升高（少见）：机体明显失水。35结构：MW=54000，四个相同亚基构成的四聚体。理化性质：pＩ＝4.7，肝细胞合成，半寿期12小时。测定方法：免疫比浊法／免疫扩散技术。（三）前白蛋白（PA，TTR）急性时相反应蛋白36即甲状腺素转运蛋白（TTR），50%--70%的TTR与视黄醇结合蛋白（RBP）组成复合体，由于TTR电泳位置在白蛋白之前故命其为PA。TTR和RBP均由肝脏合成，为运载和营养蛋白。功能：营养指标，载体功能（甲状腺素／维生素Ａ）。参考值：0.2—0.4g/L临床意义：PA下降是肝功能不全的灵敏指标；降低：营养不良，急性炎症，恶性肿瘤，肝硬化及肾炎时。37结构：394个aa残基构成的单链多肽，含10％～12%的糖MW=5.5万。也称丝氨酸蛋白酶抑制物。理化性质：pI值为4.8，占α1-球蛋白区带显色的90％。测定方法：免疫化学法，电泳（酸性凝胶电泳或等电聚焦电泳），利用蛋白酶抑制能力测定等。功能：蛋白酶抑制物（具有90％的抑制蛋白酶活力）。如糜蛋白酶，弹性蛋白酶，但此抑制作用有明显的pＨ依赖性。（四）α1-抗胰蛋白酶（AAT）急性时相反应蛋白3839常染色体共显性遗传，有多种遗传表型现已发现至少有75种基因变体主要根据电泳迁移率分类移动快的AAT变体用字母表前面的字母表示，移动最慢的基因以PiZ表示。F型--fast,M型--middle,S型—slow具有正常功能的是PiMM型，最常见的缺陷变体为Z和S型，表现为以下基因型：ZZ、SS、SZ、MZ、MS。ATT基因的遗传表型降低：（1）见于AAT缺陷：PiZZ型、PiSS型甚至PiMS型常伴有早年（20～30岁）出现的肺气肿低血浆AAT可发现于胎儿呼吸窘迫综合征ZZ蛋白聚集在肝细胞，导致肝硬化PiZZ表型的新生儿中10%～20%在出生数周后易患肝炎，最后因活动性肝