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2菌种选育菌种的来源诱变育种抗噬菌体菌株的选育杂交育种原生质体融合技术菌种保藏第一节菌种的来源获得微生物和新产物，关键是：①、选择合适的微生物源；②、建立科学的筛选方案(检测系统)。要求：选择性强、灵敏度高。（一）微生物是生物产物的主要来源之一一、生物物质产生菌的筛选可用固体培养或液体培养。次级代谢物大规模生产是液体深层培养法，由于固、液两种方法产生次级代谢物的方式不一样，因此，以液体培养法为主要筛选手段。（二）筛选时的培养类型选择性分离方法大致可分为五个步骤：二、微生物选择性分离的原理(筛选程序)①、含微生物材料的选择；②、材料预处理；③、所需菌种分离；④、菌种培养；⑤、菌种纯化。菌种来源选择标准：1、天然材料（土壤等）来源越广泛，含有目的菌的可能性越大，获得新菌种的可能性越高；2、可寻找已适应苛刻环境的微生物类群。例：从被污染的实验室培养基中分离出嗜盐菌，从盐场分离出嗜盐链霉菌。（一）含微生物材料的选择3、利用同一生态环境内的不同环境条件分离出更多种类的菌株。例如：酸性土壤圈的放线菌类群与其紧接下层的中性圈的放线菌类群有很大不同。4、自然环境的菌群可因人类的活动而改变。例如：于土壤中加入去莠津会导致放线菌菌群数量的增加。如诺卡氏菌属能生长在Carboxanilide杀真菌剂中。5、更新的生态环境仍有待开发。例如，从根瘤中分离出一株放线菌；从白蚁肠子里分离出一株类似放线菌的细菌。（二）材料的预处理（1）、物理法①、热处理：可减少材料中的细菌数。因许多放线菌比细菌细胞耐热。②、膜过滤：样品中细胞数较少时(如水)，可采用膜滤法浓缩。滤膜的品种对收集菌的类型有重要的影响。③、离心法：处理放线菌繁殖体含量很低的海水，可先将样品离心后再过滤。④、搅动释放孢子法：收集腐烂稻草和其他植物材料中的嗜热放线菌孢子可在空气搅动下进行。并可用一风筒或一简单的沉淀室收集孢子。然后，用取样器将空气撞击在含培养基的平板上。这样可以减少分离平板中的细菌数目。（2）化学法在分离前加一些固体基质(把几种基质加在土壤中)或洒些可溶性养分来强化培养基。1、选择合适分离培养基（三）所需菌种的分离①、几丁质培养基：分离土壤和水中放线菌。但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有25％的菌种具有强的水解几丁质的能力。许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌碳与氮源的“食腐菌”上，而其本身却不利用几丁质。广泛应用的选择培养基。②、淀粉-酪素培养基：长出的放线菌种类与几丁质培养基上生长的相似，但其菌落的密度更大、色素更多，同时细菌也容易生长。这种培养基中加入4.6％(m/m)的NaCl，有利于链霉菌生长，但不是所有的链霉菌都能耐受这一浓度的NaCl。③、M9培养基：养分贫乏，阻滞链霉菌的生长，容易分离到其他菌属，如红球菌。在l升烧杯中加入450ml蒸馏水（溶液A）：NH4Cl0.5gNa2HPO43.0gKH2PO41.5g用lNNaOH调整pH到7.4;制备溶液各50ml：1MMgSO4.7H2O20%(w/v)Dextrose(葡萄糖)1MCaCl2上述溶液分消。混合：1mlMgSO4.7H2O(1M)，5ml葡萄糖（20%），50ml氯化钙(lM)，450ml溶液A。M9培奉基,一种培养大肠杆菌的葡萄糖一矿物盐培养基大多数放线菌都是嗜中性的，分离培养基的pH通常在6.7～7.5之间。分离嗜酸放线菌，宜pH4.5～5.0。有人从碱性的加拿大土壤中分离出嗜碱链霉菌，不能在pH6.1～6.8下生长。估计嗜碱性放线菌也可能存在于其他碱性环境中。2、选择合适的pH3、加入选择性抑制剂。筛选放线菌时，可加入抗真菌抗生素，但不能用抗细菌抗生素，因放线菌对它敏感。如分离种类较广的放线菌，在分离培养基中加抗细菌抗生素时会使得放线菌及其细菌的数量同时减少，但如果分离的种类不那么广，可加入放线菌能耐受的抗生素，如培养基中加入新生霉素(25µg/mL)和亚胺环己酮(50µg/mL)能分离出普通高温放线菌。培养温度：放线菌25～30oC，嗜热菌45～55oC，嗜冷菌4～10oC。培养时间：是培养的主要变量，嗜温菌（链霉菌和小单孢菌）7～14d；嗜热菌（高温放线菌）1～2d。注意：有时培养时间短会漏掉一些新的和不寻常的菌株，有人在30oC和40oC将培养1个月，分离出不寻常的种属。也有人在20oC培养6周从海水中获得放线菌。（四）菌种的培养选择方法取决于筛选的最终目的。放线菌常用筛选方法：铺菌法于平板上铺一层试验菌，观察抑菌圈大小，可测定抗生素生产能力。缺点：所需要的菌落易污染，且只能在每个平板上铺上一种试验菌。（五）菌落的选择（筛选方法）筛选工业用菌株时宜考虑的指标:三、重要工业微生物的分离①、营养特征；②、生长温度最好40℃(降低发酵过程的冷却成本)；③、对设备和生产过程的适应性。④、遗传稳定性。⑤、产物得率和产物浓度。⑥、产物回收的难易度。生产性能要求获得高产菌株的同时,还要考虑生产过程中的经济问题.自然分离+保藏机构购买（1）富集培养供给特殊培养基或加入某些抑制剂。重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。（一）施加选择压力(selectivepressure)的分离方法连续富集技术：用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。为了防止菌体的早期洗出，可采用恒浊器。连续富集培养法可以筛选出能共生的稳定混合培养物，例如用甲烷作碳源筛选到甲烷营养型和一些非甲烷营养型的共生菌。有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此常需随机地分离。快速筛选方法和高产培养基成分的选择性准则如下：①、制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素(即C、N、P、O)；②、使用一聚合或复合形式的生长限制养分；③、避免使用容易同化的碳(葡萄糖)或氮(NH4)；④、确定含有所需的辅因子(Co2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+)；⑤、加入缓冲液以减少pH变化。（二）随机分离方法固体培养基的使用常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基质，以便促使酶产生菌的生长。举例：产碱性蛋白酶的菌的分离。碱性土壤铺在pH9～10的琼脂培养基(含有均匀的不溶性蛋白质)表面。根据蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。（1）抗生素产生菌筛选在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。采用联合试验菌。举例：枯草杆菌和绿色产色链霉菌可以分离出对枯草杆菌抗菌活性低、对绿色产色链霉菌活性高的新抗生素。黄色霉素族的抗生素便是用这类方法找到的。（2）药理活性化合物的筛选酶靶法：基本原理：一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的某一关键酶的作用，它在体内一般也具有相应的药理作用。若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可筛选出新的药理活性化合物。（3）生长因子产生菌的筛选核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产生菌。例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。（4）多糖产生菌的筛选曾从各种环境中分离出多糖产生菌，制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。第二节菌种选育菌种选育理论基础：微生物遗传学、生物化学等。菌种选育目的：获得高产优质生产菌株，发展新品种。要求菌种选育者：掌握微生物学、生物化学、遗传学基本原理，国内外有关先进科学技术。经典育种：自然选育和诱变育种定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控和基因工程等。自然选育：利用菌种自然突变(SpontaneousMutation)进行菌种筛选的过程。自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。一、自然选育多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质(如H2O2)的作用等。互变异构效应：五种碱基第六位上的酮基和氨基，T和G可以酮式或烯醇式出现，C和A可以氨基或亚氨基形式出现。平衡倾向于酮式和氨基时，DNA双链中以AT和GC碱基对为主。T以烯醇式出现，在DNA复制到达该点的一瞬间，与G配对；C以亚氨基出现时，在新合成的DNA单链的C点出现A—可能的自然突变原因。碱基对发生自然突变几率约10-8～10-9。自然突变两种情况：1、菌种衰退和生产质量下降；2、对生产有益的突变。为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，从中选出稳定菌株用于生产。自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的.缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提高.自然选育程序：把菌种制备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株。（一）诱变育种基本原理诱变育种理论基础：基因突变。二、诱变育种突变类型：染色体畸变：染色体或DNA片断缺失、易位、逆位、重复等。基因突变：指DNA分子结构中某一部位发生变化(点突变)。根据突变的发生分自然突变和诱发突变。自然突变：自然条件下出现的基因突变。诱发突变：用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素：物理因素和生物因素、化学因素。诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA的化学结构发生改变，引起微生物遗传变异。诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提高—获得特性优良变异菌株的几率高。（二）诱变育种一般步骤诱变：由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液(或细胞悬液)作诱变处理，然后以一定稀释度涂平皿，至平皿上长出单菌落。诱发突变所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量、使用方法密切关系—诱变成功的关键。筛选：将单孢子（细胞）分离长出单菌落后随机挑至斜面；初筛和复筛进行生产能力测定和菌种保存。诱变和筛选不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。考察其稳定性、菌种特性、最适培养条件等后，再中试、放大。（1）出发菌株出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。（三）几个应注意的问题（2）复合诱变因素的使用野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可获得高产菌株。乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都用得较普遍，且有一定成效。氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时能促进突变。（3）剂量选择UV剂量单位：焦耳；X射线剂量单位：库(仑)/kg；中子剂量单位：戈。化学诱变剂剂量单位：溶液浓度。变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。（4）变异菌株的筛选诱变目的：高产菌株、新产物。挑选菌株一般从菌落形态、变异类型着手，发现与产量有关的特性，根据这些特性，按类挑选一定数量的典型菌株进行发酵和鉴定，确定各种类型与产量间的关系，可大大提高筛选效率。（5）筛选条件—获得高产菌株的关键在初筛培养基中适当增加淀粉和硫酸铵，可筛到能利用较高浓度糖和氮及效价比原菌株略高的产土霉素突变株。用该培养基连续筛选。进一步增加糖、氮，发酵差距更大，代谢慢的菌株，效价更低，对糖、氮利用能力强的菌株，效价更高。诱变育种时应正确处理出发菌株，诱变因素和筛选条件三者的关系。诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态，必须进行自然分离—诱变育种和杂交育种必须环节。自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。（四）常用诱变剂及其使用方法（1）紫外线(UV)最有效波长为253～265nm。一般用菌(孢子)悬浮液进行处理，功率15W，距离固定在30cm±。机制：形成胸腺嘧啶二聚