2-1免疫组织化学技术.

第四章、免疫组织化学技术Immunohistochemistry吉林大学白求恩医学院组织胚胎学系李树蕾2014-6-16概念：应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些多肽和蛋白质等大分子物质进行原位定性、定位或定量研究的技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。基本过程：被检抗原/半抗原提取→免疫动物→特异性抗体→标记抗体→抗原抗体反应部位出现有色沉淀能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有反应原性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖和所有的类脂都属于半抗原。免疫酶组织化学免疫荧光组织化学免疫胶体金组织化学亲和免疫组织化学（抗原信号放大系统）优点：特异性强，敏感度高，应用广泛。第一节免疫组织化学基本原理一、直接法用酶或其它标记物标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原结合，再与酶的底物作用产生有色产物沉积，在抗原抗体反应的部位即可检测。优点：简单快速，特异性强，非特异性反应低；缺点：敏感性差；抗原量要求高；很难获得各种市售标记抗体。（肿瘤蛋白标记物：低丰度蛋白）在免疫荧光和免疫酶技术中因材料处理不当或用量不当产生的背景着色反应。第一抗体（兔）不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段（有种属特异性）作为抗原免疫动物（羊），制备抗抗体，即第二抗体（羊抗兔），并标记第二抗体。二、间接法染色时，顺次以第一抗体和标记的第二抗体处理标本，在抗原存在部位形成抗原-第一抗体-标记第二抗体复合物，以达到检测该抗原的目的。优点：间接法因第二抗体的放大作用敏感性大大增高（放大原理=抗原：抗体1：6）；缺点：可能出现非特异性反应；子宫内膜巨噬细胞移动抑制因子MIF三、亲和免疫组织化学(一)亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，ABC法)特点:以亲和素作为“桥”将生物素结合的酶和生物素化的抗体连接起来，使抗原与抗体反应信号放大，以增加敏感性。1.原理:生物素(biotin)为含硫的杂环单羧酸，生物素分子量为244.31，pI为3.5，咪唑酮环（又称Ureido环）(I环)是与亲合素结合的主要部位；Ⅱ环为噻吩环有一个戊酸侧链，末端羧基是标记抗体和酶的唯一结构。III亲和素(avidin)又称抗生物素蛋白，是一种糖蛋白。天然(卵白)亲合素为碱性蛋白，分子量为6.8KD，pI10～10.5；在pH9～13缓冲液中性质均稳定。由4个相同的亚单位构成4聚体；每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的Ureido环（I环）结合。因此，1个亲合素分子存在4个与生物素分子结合位点ABC法亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法ABC法原理2.免疫组织化学酶类标记物免疫组化标记物的酶以共价键结合在抗体上，ABC法则采用生物素-亲和素系统，制成酶标抗体，再借助酶对底物的特异催化作用，生成有色不溶沉淀，在光镜下进行各种抗原成分观察。常用酶类：辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP),碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，AP)用于标记的酶的特性酶催化反应形成的产物易于在光镜下观察酶反应终产物是稳定的沉淀，不会从酶活性部位向四周弥散而影响组织学定位较易获得纯的酶分子中性PH值时，酶分子稳定酶连接在抗体上，二者活性均不受影响HRP底物:过氧化物：过氧化氢供氢体：二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)3-氨基-9乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbozole,AEC)DAB+H2O2棕色；AEC+H2O2紫红色AP磷酸酯水解酶，溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)溴氯羟吲哚磷酸盐(底物）/硝基四紫唑(BCIP/INT)NBT/BCIP蓝紫色INT/BCIP棕红色或橘黄色HRPHRPAPAPABC法的优点：敏感性更高ABC法的缺点：①亲和素(鸡蛋白)中含有10%糖类，导致背景着色②亲和素的等电点约10左右，带较多的负电荷，导致纤维组织着色。③内源性生物素导致背景着色④亲和素中有4个结合点，其中一半与连接抗体结合，另一半与复合物结合，可降低其敏感性。链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(streptavidin-biotin-peroxidasecomplexmethod，SABC法)(二)链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法（Streptavidin-peroxidasemethod，SP法）链霉亲和素替代ABC法中的亲和素-生物素复合物，形成链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶法，SP法Ag1Ab2AbDABABCmethodDABSPmethodA-B-ComplexSa-P-ComplexPABPSa放大系统→←1.链霉亲和素SA（链霉菌抗生物素蛋白）约6.5KD，由4条相同肽链构成，每条肽链可结合1个生物素分子。每个SA有4个生物素结合位点，结合常数与A相同为1015mol/L，约为抗原抗体间ka（105～1011mol/L)的1万倍以上。SA最高的活性可达18u，较A高（15u）；SA的四个亚基可以全部和二抗上的生物素结合。2.链霉亲和素组织穿透性强，反应速度快。3.等电点为5.5~6.7，接近中性，所带的负电荷少；4.链霉亲和素不含糖基。5.敏感性更高，特异性更强。SP法的优点第二节、免疫组织化学染色步骤一、免疫组化染色步骤（一）石蜡切片1.烤片：58℃2-６h；目的：带蜡的组织切片牢固黏在载玻片上注意：高温加速组织中抗原氧化2.脱腊和水化：二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15min脱蜡→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分别浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪酒精各浸泡2min→PBS洗3次×3min,置蒸馏水中待用；3.抗原修复：甲醛形成醛键、羧甲基等封闭部分抗原决定簇；蛋白分子交联隐蔽了抗原决定簇。加热修复：①高压修复：pH6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液高压锅内煮沸，切片置于其中,高压修复1.5min，室温冷却，蒸馏水和PBS各冲洗2次×3min；注意：时间过长背景加深；新鲜柠檬酸缓冲液；缓冲液足量②微波修复：pH6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液微波煮沸，切片置于其中，中高档微波处理15-20min，室温冷却，蒸馏水和PBS各冲洗2次×3min；③蒸汽修复:内，盛自来水的铝制容器加热至水沸腾,放入含pH6.0的0.1mol／L柠檬酸缓冲液和切片的容器.继续沸腾10-15min,室温冷却.(强烈推荐)胰蛋白酶消化：细胞内抗原0.1%胰酶溶液（0.1%氯化钙pH7.8），37℃，15-30min，,PBS冲洗3次×3min；胃蛋白酶消化：细胞间质抗原0.4%，37℃，30-180min注意:酶溶液新鲜配制;或分装冻存;要预热建议：仔细阅读抗体说明书，是否需要进行抗原修复，选择合适的抗原修复方法和时间。单一方法无效,可联合应用,适合于免疫组化双重标记或多重标记.4.细胞膜打孔0.1﹪-0.3％tritonX-100浸泡，RT，25min，PBS冲洗3次×5min原理:tritonX-100为脂溶性去垢剂注意：检测膜抗原可省略此步骤；石蜡切片和冰冻切片可以省略此步骤。使抗体渗透进入细胞的方法（1）TritonX-100：使细胞膜脂类溶解（2）Np-40：使细胞膜蛋白质破环（3）Saponin皂苷：使细胞膜胆固醇溶解5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素（1）灭活内源性过氧化物酶：3﹪甲醇-H2O2浸泡，RT，30min，PBS冲洗3次×5min；（2）灭活碱性磷酸酶：以每毫升24mg左旋咪唑加入底物液中，保持PH7.6－8.2。酸性磷酸酶用0.05M酒石酸抑制。（3）灭活内源性生物素：有些组织(腺上皮、脑和胚胎组织)内源性生物素含量比较高，特别在使用高温加热修复方法暴露抗原决定簇后，组织内源性生物素大量暴露，容易造成假阳性。内源性生物素阻断试剂盒：阻断剂A液（0.01%亲和素）1滴，RT，10min，PBS冲洗3次×2min；加B液（d-生物素）1滴，RT，10分钟，PBS冲洗3次×2min。6.非免疫血清封闭：原因：富含正电荷的胶原和结缔组织吸附抗体目的：吸附带正电荷的蛋白操作：与二抗种属相同的非免疫血清或2-5﹪BSA（牛血清白蛋白），RT，10min，不洗；注意：结合不牢固，不能冲洗建议：可试用不同动物的非免疫血清（不要与一抗种属相同）7.加入一抗4℃过夜，或37℃孵育1-2h，PBS冲洗3次×5min多克隆抗体兔多抗价格低，效价高非特异性反应高，效价不稳定单克隆抗体小鼠单抗大鼠单抗兔单抗特异性强，无交叉反应，效价稳定价格高，效价低浓缩型抗体摸索效价市售抗体稀释液，或含1-3%非免疫血清PBS即用型抗体无需摸索效价8.加入生物素标记IgG(二抗），RT,10分钟，PBS冲洗3次×5min；注意：与一抗匹配9.加入链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶（SABC-POD，或SABC-AP），RT,10min，PBS冲洗4次×5min10.AEC或DAB（或NBT/BCIP）显色显色过程为2～10min（镜下监控，AEC不能长期保存），蒸馏水或自来水冲洗；若DAB显色进行以下操作：11.苏木精复染（10秒钟），自来水冲洗返蓝，脱水透明，用中性树胶封片。镜下检查结果若AEC或NBT/BCIP12.AEC和NBT/BCIP显色可进行甲基绿或核真红复染细胞核，水溶性封片剂封片。DAB显色ChAT免疫组化检测结果AEC显色Prostate–Doublelabel•Cytokeratin5(m),APsubstrate(blue)CD34(m),AEC（red）