2-2免疫组织化学技术.

第四章、免疫组织化学技术Immunohistochemistry吉林大学白求恩医学院组织胚胎学系李树蕾2012-11-6（二）冰冻切片免疫组化染色1.恒冷箱切片：新鲜组织或－80℃保存组织切片10-14um；2.裱片和晾干,密封-20℃短期保存；3.染色前冷丙酮4℃固定10-20分，PBS冲洗2次×5min；4.必要时细胞膜打孔。5.通常苏木精复染细胞核，水溶性封片剂封片。(三)培养细胞免疫细胞化学染色1.固定贴壁细胞制备细胞爬片；悬浮细胞制备滴片或者甩片4%多聚甲醛或冷丙酮室温固定10-20min2.晾干易脱片的细胞大于2h，PBS冲洗2次×5min；3.细胞膜打孔二、SABC法与免疫组织化学染色其它方法比较（一）SP法或SAP法（二）EnVisionTMSystems将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶结合形成聚合物,代替传统方法的二抗和三抗,直接与特异性第一抗体结合，放大了抗原抗体结合的信号，使检测变得简单而且敏感性增加。（三）Maxvision法根据聚合物技术把过氧化物酶与抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚肽上形成多聚物分子，可以避免由于生物素引起的非特异性背景显色.三、免疫组织化学染色结果评价排除非特异性染色、假阴性、假阳性结果阳性对照实验阴性对照实验非特异性染色细胞和间质染色无区别，或间质更强染色无特定部位、无结构性染色分布无规律，某一部位均匀染色染色出现在干燥部位、边缘、刀痕、组织折叠处。（一）以抗原表达模式定位1．细胞质内弥漫性分布，即胞质型阳性反应；2．细胞核周边胞质内分布，其判别要点是细胞核轮廓被勾画得很清楚。3．胞浆内局限点状阳性反应。4．细胞膜线性阳性反应，大多数淋巴细胞标志物的染色均如此。5.细胞核阳性反应如BrdU及雌、孕激素受体蛋白等。有些抗原的阳性表达也可同时出现在细胞的不同部位，如细胞质和细胞膜等。(二)阳性染色结果定量1．计算免疫反应阳性细胞数每个样品中10个非重叠视野；至少三个条件相同的样品；柱形图；0102030405060708090ChAT免疫反应阳性细胞百分率control102040培养液中BMP4的浓度（ng/ml)图表1.不同浓度BMP4对ChAT阳性免疫反应细胞数量的影响2．以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定阴性0~25个﹢25~50﹢﹢50~75﹢﹢﹢﹥753.图像分析系统检测阳性结果（详见第七章）四、讨论（一）实验计划目的拟用方法操作流程方案预期结果分组试剂准备:一抗二抗的种类和效价器材准备：冰箱湿盒免疫组化笔玻璃笔滤纸等设置对照对每一抗体均应配阳性和阴性对照。（二）抗体的稀释度最佳抗体浓度可提高染色质量，与周围组织形成良好对比表4-1.确定一抗的最佳工作浓度一抗稀释度特异性染色强度非特异性染色背景强度1:50十十十十十十1:100十十十十1:200十十一阴性对照一一在一抗稀释度1:100和1:200之间可找出最佳稀释度。抗体的种类（多、单克隆抗体；即用、浓缩抗体）抗体的稀释液：10mg/mlBSA和0.05(v/v)%Tween20加入0.01molPBS液(三)滴加抗体注意事项（组织切片、细胞培养）吸掉多余液体；注意：避免碰到组织或细胞避免干燥；注意：一次处理少数切片滴加抗体在组织表面免疫组化笔适用于培养细胞，注意：轻摇动数秒，使抗体分布均匀（四）抗体的保存1．抗体分装浓缩型-20℃冰箱保存2．抗体稀释用前涡旋混匀，4℃，1-2个月3．无菌与消毒与抗体接触的工具消毒(五)对照实验非常重要常用的对照组有以下几种：一、阳性对照用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染色过程中各个步骤以及所用的试剂都合乎标准，染色方法可靠。特别是当待检的标本为阴性结果时，阳性对照呈阳性反应，可排除待检标本假阳性的可能。所以若预期染色结果是阴性时，就必须设阳性对照。二、阴性对照用确知不存在待检抗原的组织切片染色，结果为阴性。阴性对照可证实组织内若不含靶抗原，就不应染色，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的“假阳性”结果。三、空白对照是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色。四、替代对照用与一抗来源相同动物非免疫血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。五、吸收试验对照用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。六、自身对照用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。对照实验方法和结果分析对照种类靶组织实验试剂阳性反应意义阳性组织对照组织中含待测抗原按常规操作流程提示操作系统的试剂和操作方法无误一抗阴性对照替代组织中待测抗原未定用与第一抗体相同种属正常血清取代一抗或用PBS取代一抗，其余步骤不变。提示有非特异性反应存在二抗阴性对照替代组织中待测抗原未定用与第二抗体相同种属正常血清取代二抗或用PBS取代二抗，其余步骤不变。提示一抗对组织有非特异性吸附或组织内未灭活内源性酶(六)免疫组织化学技术应用的基本原则免疫组织化学技术的局限性：组织细胞内的待测物质要有抗原性；有一定浓度方可检测出；检测出的阳性蛋白不能被确定是细胞新合成的蛋白还是通过细胞间运输而来的蛋白。应用的基本原则1.确定细胞类型和形态组织特异性蛋白GFAP、NF2．辨认细胞产物的来源针对细胞产物的抗体胰岛素3．确定细胞的分化程度不同时期的标志性蛋白NestinvimentinTublinNF4．追踪神经纤维束和它的投射区轴质逆行运输5.在临床病理中的应用如鉴定病变性质，发现微小病灶，探讨肿瘤起源或分化表型，确定肿瘤分期，指导治疗和预后，辅助疾病诊断和分类，寻找感染病因等。AFP顺向示踪皮质脊髓束（皮层注射）荧光红逆向示踪（单侧坐骨神经末梢注射荧光红）第三节免疫组织化学双重染色需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存。1.条件：不同种属来源的特异性抗体双重染色；两种抗原最好在不同部位；两种抗体的抗原修复方法一致;应用两种不同的显色系统或不同颜色的荧光（HRP和AP或FITC和TRITC)。2.与单染不同点：①在第一种抗原显色后，加双标阻断液或0.05%盐酸,RT，10min，避免已显色的抗原褪色。②滴加非免疫血清（与二抗同种属）37℃，10分钟。（不洗）③接着加入第二种一抗37℃孵育，30min或4℃过夜；④重复以前的步骤。（注意：二抗的种属性，复合物中酶不同）Prostate–Doublelabel•Cytokeratin5(m),APsubstrate(blue)CD34(m),AEC（red）