2-从纤维细胞进行多能干细胞的诱导

从纤维细胞进行多能干细胞的诱导EScell的临床应用所面的的困难是胚胎的使用和移植后的组织排斥反应。避免这些问题的一个方法是直接从体细胞诱导出多能干细胞，体细胞可注射核到无核卵母细胞中或者与Escell融合而被重编到类似胚胎状态。然而这个程序潜在的机理却知道的很少。最近证明四个转绿因子的组合可从鼠纤维细胞中诱导出类似ES的多能干细胞。这种被命名为IPScell可分化为三胚层并可被放置在嵌合鼠中。这儿，我们提供了有关诱导的详细方法和介意。介绍人EScell的临床应用所面的的困难是人胚胎的使用和移植后的组织排斥反应。避免这些问题的一个方法是直接从体细胞诱导出多能干细胞。两种方法可以长生这样的结果：核转移到卵母细胞和与EScell融合最近报道证明受精卵可被用于核移植。另外研究表明融合介导重编被Escells中的转录因子Nanog的过表达促进。然而，这些方法仍需要胚胎或卵母细胞去诱发多能细胞，因此，仍逃不了道德问题。另外，融合介导的方法需要去除源于ES-cell的染色体。体细胞通过核转移入卵母细胞或者与Escells融合可被重编的事实表明卵母细胞和Escells含有可以诱导重编的因子。我们假设对于维持Escells的多能性其重要作用的因子对于体细胞重编也起重要作用。。mouseEScells的多能性长期维持需要转录因子(e.g.,Oct3/4,Sox2andNanog)的特定表达，以及激活大量表达的肿瘤相关基因(e.g.,Stat3,c-Myc,Klf4和b-catenin)。测试这些候选基因诱导多潜能的活性，我们发展了一种系统，系统中多潜能的诱导可被标记基因表达检测，我们使用只在mouseEScells和早胚中特定表达的Fbx15，但对Escells的自我更新和发育是非必要的。我们通过同源重组将bgeo基因盒(融合b-半乳糖苷酶和抗新霉素基因)插入鼠Fbx15基因中。Bgeo敲入(Fbx15bgeo/bgeo)的Escells纯合子对极高浓度的G418(达到12mg/ml)有抗性，然而源于Fbx15bgeo/bgeo鼠鼠的体细胞极易筛选。我们希望即便部分多能性的诱导也可使体细胞对标准浓度(0.3mg/ml)的G418有抗性。我们通过发转录病毒介导转染将候选基因引入Fbx15bgeo/bgeo鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)并用含G418的Escell培养基培养它。用任何一个单因子我们都不能获得抗G418的克隆。然而通过四因子(Oct3/4,Sox2,c-Myc和Klf4)的组合，我们获得了多样的抗G418的克隆。这些细胞显示出与Escells相似的形态学和增殖能力。将这些类似Escells的细胞移植到裸鼠体内，会产生包含三胚层不同组织的畸胎瘤。近期，使用Nanog作为筛选标记，我们能够通过四因子诱导出生殖能力。这些数据证明多能细胞可从纤维细胞中用特定因子诱发。iPScells需要分子和细胞生物的基本技术，它不需任何特殊装备和技术。这里我们描述了有关iPScells详细的方法和秘诀。Figure1b给方案的主要阶段一个概观并描述了随着时间的推移这些阶段如何协调。材料试剂pMXs由5¢-长末端重复(LTR)和3¢-LTR均来自莫罗尼鼠白血病病毒，Plat-Ecells衍生自293Tcells并含有由EF1-a启动子启动的env-IRES-puroR和gag-pol-IRES-bsR基因盒。pMXs包含Oct3/4,Sox2,Klf4或者c-Myc的cDNAs，从Addgene获得。我们使用pMXs反转录病毒载体编码GFP来监控感染效率。它也可用于iPScell诱导的阴性对照。Fbx15bgeo/bgeomice获得于日本理化研究所，Fbx15基因区域外显子的3到8个通过同源重组被RF8Escells中的报道基因盒IRES-bgeo-pA所取代。bgeogene的表达由内源基因Fbx15驱动。携带Fbx15bgeo/+的Escellclones被注射到胚胎去诱发Fbx15bgeo/+和后续的Fbx15bgeo/bgeo鼠。NanogGFP-IRES-Puromice获得于日本理化研究所，报告基因盒GFP-IRES-PuroR被引入细菌人工染色人体（BAC）中Nanog基因的5¢-非翻译区。被修饰的BAC被线性化并通过电穿孔引入RF8。携带修饰过BAC的Escells被注射到囊胚去诱发Nanog–GFP报告基因鼠。SNLfeedercells获得于Dr.AllanBradleyoftheSangerInstitute。SNLcells源于STO细胞系并稳定表达neomycin-抗性基因盒和白血病抑制因子表达构建。注意：SNLP76/7-4feeder细胞系，它是抗puromycinSNL的衍生物，获得于Dr.AllanBradley。铺明胶的培养版准备储藏浓度为10*明胶(1%wt/vol)。溶解1g的明胶粉末于100ml的蒸馏水中，高压灭菌并储藏在4。C。准备0.1%(1*)明胶溶液，在微波炉中溶解10*明胶储藏液，加入50ml于450ml蒸馏水中，用瓶盖滤器过滤溶液并储藏在4。C。铺明胶，加足够量的0.1%明胶溶液去覆盖整个皿底。例如1,3或5ml明胶溶液分别被用于35-,60-or100-mm皿，在37。C孵化至少30min，使用前，吸出过量明胶。0.5%胰酶/5.3mMEDTA溶液准备0.05%胰酶/0.53mMEDTA，混合10ml的0.5%胰酶/5.3mMEDTA溶液和90ml的PBS。准备0.1%胰酶/1mMEDTA，加20ml的0.5%胰酶/5.3mMEDTA溶液到80ml的PBS中，高压灭菌并储藏于–20‘C。飘零霉素溶解于蒸馏水到10mg/ml并过滤杀稻揾菌素盐酸盐ES培养基DMEM含有15%FBS(vol/vol)，2mML-Gin，1×10–4M非必须氨基酸1×10–4M2-巯基乙醇，50U和50mgml–1双抗。准备500ml的培养基，混合75ml的FBS，5ml的L-Gin，5ml非必须氨基酸，1ml的2-巯基乙醇和2.5ml的双抗，随后用DMEM加到500ml藏于4℃一周。SNL培养基DMEM含7%FBS，2mML-Gin，50U和50mgml–1双抗。准备500m需混合35m的FBS，5ml的L-Gin和2.5ml的双抗，随后用DMEM加到500ml藏于4℃一周。FP培养基(针对纤维细胞哦Plat-Ecells)DMEM含10%FBS，50U和50mgml–1双抗。准备500m需混合50ml的FBS和2.5ml的双抗，随后用DMEM加到500ml藏于4℃一周。对于Plat-Ecells，加1μlmg/ml嘌呤霉素储藏，10mlFpmedium需加10ul的10mg/ml的blastcidinS。过程纤维细胞的准备1）从鼠胚胎或鼠尾尖获得纤维细胞。一般，较多的iPScolonies从胚胎得到。a.鼠胚成纤维细胞的准备（1）通过颈椎错位杀死13.5d的受孕母鼠。分离出子宫并用PBS简单的清洗。（2）用钳子从胎盘和包膜中分离胚胎，去除头、内脏组织和分离胚胎的生殖腺。（3）将胚胎转移入含新鲜PBS的100-mm皿清洗。用剪刀剪碎剩下的遗体，转入50-ml含0.1%胰酶/0.1mMEDTA溶液(3ml每个胚胎)的圆锥管，37℃孵化20min。（4）再加0.1%胰酶/0.1mMEDTA溶液(3ml每个胚胎)，37℃孵化混合物20min。（5）添加等量的FPmedium(6ml每个胚胎)，吹吸几次促进组织分离。（6）将组织和培养基混合物置于室温5min(20–25℃)去除杂物，转移上清液到一个新的50-ml锥形馆。于200g条件下离心5min，弃上清，用新鲜培养基重悬球状物。（7）计数并调整密度为1×106个细胞每ml的Fpmedium，一般单个胚胎可获得1×107个细胞，转移细胞悬浮物到100-mmt组织培养皿并于37℃、5%CO2条件下培养24h（一代）。（8）第二天，用PBS清洗去除漂浮细胞。（9）当细胞汇合，去除Fpmedium，用PBS在洗一次，用1ml的0.05%胰酶和0.53mMEDTA消化5min。脱壁后加9ml的Fpmediuma吹悬。按1:4传代到新100-ml皿中（2代）。对于iPScells诱导，使用3代以内的MEFs以免复制衰老。(B)从鼠尾尖获得成纤维细胞的准备TIMING10d（1）从成年鼠剪下尾尖，用PBS清洗。（2）用注射针头划一道纵向切口，用手将表皮剥去，用剪刀将余下的尾尖切成1-cm碎块。在铺明胶的6孔板中每孔放两块，加2ml的MF-startmedium并于37℃下培养5天，期间纤维细胞从尾尖迁移出来。（3）用灭菌钳子去除尾尖组织并丢弃，重新加入2ml的Fpmedium，当他们汇合时培养细胞。（4）吸出培养基，用2ml的PBS再次清洗并添加0.3ml的0.05%胰酶/0.53mMEDTA，37℃下孵化10min。（5）加2ml的Fpmedium，悬浮细胞，转移并收集到15-ml试管中，160g离心5min。（6）弃上清，用10ml的Fpmedium重悬细胞，并铺到100-mm组织培养皿中（2代）。（7）当细胞汇合，去粗Fpmedium，用PBS在洗一次，1ml的0.05%胰酶和0.53mMEDTA消化5min。随后用