2005-分子克隆技术--精品课程.

分子克隆技术华中农业大学生命科学技术院李香花：87282044吴昌银：87281887实验简介分子克隆是指DNA的无性繁殖技术。本课程主要是针对生物技术、生物科学专业本科生及分子生物学专业研究生而开设的以实验为主的必修课，共60学时。内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧。实验包括：分子克隆、分子杂交和表达分析分子克隆技术：利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等分子杂交技术：主要通过做Southern杂交，掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、Southern转移、探针的制备、同位素操作等方面的操作技术表达分析:通过做RT-PCR掌握RNA的抽提，质量检测及RT-PCR的操作实验注意事项在整个实验过程中都应严格遵守实验室的规章制度，不准违规操作仪器。损坏物品的赔偿制度离心机：平衡、离心管配套、转速移液器：不能超量程使用、不能倒置、小心摔坏化学药品：腐蚀性、诱变剂、放射性物质实验过程中和实验完毕注意水、火、电保持实验室安静、清洁实验考核：平时成绩＋实验报告＋考试成绩用质粒载体克隆水稻DNA片段第一部分：分子克隆技术实验内容质粒载体的抽提琼脂糖凝胶电泳限制性内切酶消化：外源片段、载体感受态细胞的制备外源DNA片段与质粒载体中的克隆重组子的转化及筛选、鉴定是一个复制子：载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来载体必备条件PlasmidCosmid,FosmidP1YAC(YeastArtificialChromosome)BAC(BacterialArtificialChromosome)MAC(MammalianArtificialChromosome)PAC(P1-derivedArtificialChromosome)BIBAC(Binary-BAC)TAC(Transformation-competentArtificialChromosome)基因克隆相关载体实验一质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的制备过程质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，大小在1－20kb之间，是双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）质粒的基本特点Multiplecloningsite从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可(松驰型质粒)。严谨型质粒（拷贝数较低）可采用氯霉素扩增的办法来扩增质粒细菌培养物的生长1通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法。（具体采用何种方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）细菌的收集及裂解solutionI重悬细菌后，加入solutionII，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开，当加入SolutionIII中和后宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。碱裂解法质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积95％乙醇混匀，冰上放置10分钟；质粒的纯化：一般采用苯酚/氯仿纯化质粒;为满足较高要求，可采用氯化铯密度梯度离心实验步骤1.取含有pUC18质粒或BAC的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；2.用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250r/min过夜培养；3.吸取1.5ml菌液，12000g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；4.加入300l溶液I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；5.加入300l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；6.加入300l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；7.12000g离心10分钟；8.吸取800l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；9.12000g常温离心15分钟；10.倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）11.加40l灭菌超纯水或TE溶解；12.质粒的质量检测，于-20℃保存。SolutionI:Tris.HCl（pH7.5）50mMEDTA10mMRNase100µg/mlSolutionII:NaOH0.2MSDS1%SolutionIII:FinalconcentrationKAc1.32MUsingHActoadjustpHto4.8TE(pH8.0)Tris.HCl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）1mM氨苄青霉素（ampicillin）：能够杀死正在生长的大肠杆菌，其主要通过抑制肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成。氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解。RNaseA:C或U的3’－P与相邻的5’－OH处切开。（配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮10－30分钟之后分成小份储存于－20℃）。1.DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.8－2.0；1.8最佳，低于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。2.质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。3.DNA浓度：1OD＝50g/mlDS-DNA或1OD＝40g/mlRNAorSS－DNA质粒DNA质量检测2实验二琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。实验材料：质粒DNA、植物总DNA或它们的酶切产物。实验原理：在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。3实验步骤：1.用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2.调整好梳子的高度；3.称取0.24g琼脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；4.凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5.将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；6.将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7.电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5µg/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。影响DNA迁移速率的因素DNA分子大小：迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）琼脂糖浓度：logU=logU0Kr胶浓度，U为迁移率，U0为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAAgarose：0.5%：1-30kb；0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm碱基组成与温度：一般影响不大4-30℃嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。质粒电泳检测：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型）质粒电泳检测实验三感受态细胞的制备体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法：CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106～107转化子/gDNA。电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。109～1010转化子/gDNA；1.前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2.取1ml过夜培养物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；3.将0.1MCaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4.吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；CaCl2感受态细胞的制备（一）5.4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；6.弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7.4℃下4000rpm冷冻离心10分钟；8.弃去上清，加入100l预冷0.1MCaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9.细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%～20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。CaCl2感受态细胞的制备（二）1.密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3.所使用的器