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第二题：1.试述原核生物和真核生物基因结构的不同之处。相同：都是由生物基本单位中的所有核酸序列组成，都有重复序列和单一序列，都是生物的遗传物质……区别：1、真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序（unique-sequences），DNA仅有少量的重复顺序和基因。真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括：.内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组中。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。5、真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。2.试述PCR反应体系中各因素对PCR反应影响。（1）模板DNA（Template）有DNA模板和RNA模板。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。（2）引物（primer）包括上游引物和下游引物。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。（3）酶及其浓度。目前有两种，一种是商用TaqDNA聚合酶，另一种是基因工程酶（大肠杆菌合成）。酶的浓度过高引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。（4）dNTP的质量与浓度。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。（5）Mg2+浓度。Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活剂，Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增；浓度过低，降低TaqDNA聚合酶的活性，是反应产物减少。（6）PCR反应的缓冲液。给TaqDNA聚合酶提供一个最适的酶催反应条件。3.基因克隆过程为何要进行筛选？请说明蓝白斑筛选的原理（1）筛选的目的：因为不同的重组DNA分子获得不同的转化子，需要我们从这些转化子中鉴定出含有目的基因的转化子。为了确认目的基因，需要利用一些方法筛选出阳性克隆进行测序。（2）蓝白斑筛选的原理：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。4.以表皮生长因子受体（EGFR）为例，请说明Ras-Raf-MAPK通路。表皮生长因子受体（EGFR），该受体是erB酪氨酸受体家族的成员之一。该家族共有四个成员，即EGFR,HER2,HER3,HER4,激活其下游的主要三条信号传导通路：Ras-Raf-MAPK通路，磷脂酰三磷酸肌醇（PI3K）和丝氨酸蛋白激酶，（AKT），JAK和STAR通路。表皮生长因子受体信转导通路是在细胞增值的加速、细胞生存期延长、肿瘤形成、新生血管的发生及肿瘤进展方面具有重要作用。研究表明，80%以上的头颈部鳞癌具有表皮上皮因子受体的过度表达。因此，EGFR及其配体在上皮肿瘤的发生发展和转移过程中所起的重要作用已获公认。EGFR与相应配体如EGF、TGF-α等结合后,会激活Ras蛋白,并主要通过Ras-Raf-MAPK通路将信号传递至细胞核内,进而抑制肿瘤细胞凋亡、引起肿瘤细胞增殖、增加新生血管生成、促进浸润及肿瘤转移。5.何为肿瘤早期诊断标记物？如何设计实验验证某一标记物是早期诊断标记物？标记物的临床价值评价有哪些？肿瘤标记物是某些肿瘤细胞上存在或分泌、排出到体液中的物质，可大致分为肿瘤细胞分泌物和肿瘤细胞表达物两类。前者是肿瘤细胞在发生、发展中产生的物质，肿瘤生长越旺盛、其量越多，反之，肿瘤生长被压制、其产生量也减少。这里有份免疫荧光测肿瘤标记物的一.直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水(PBS)：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只(内有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml)有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。实验步骤1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间(参考：30min)。3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不时振荡。4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++--++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，即可判定为阳性。肿瘤细胞产生和释放的某种物质，常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或宿主体液中，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤细胞的生物化学性质及其代谢异常，因此在肿瘤病人的体液、排除物及组织中出现质或量上改变的物质，这些就是肿瘤标记物。肿瘤标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等肿瘤标志物应用价值1.普查：2.定位：3.确诊：4.分期：5.疗效监测6.预后7.预测6基因治疗中实验基因转移有哪些方式？如何调控治疗基因在靶细胞中的表达？用于基因治疗的基因转移方法主要包括生物学方法(1至4)和生物学方法(5至3):1逆转录病毒载体介导法(随机整和,具有破坏细胞生长的必需基因,破坏抑癌基因,激活原癌基因等潜在危险.);2腺病毒载体介导法(不整和,安全性较高;不能稳定表达.);3腺相关病毒(AAV)载体介导法(可靶向整和,不能独立复制,对人类无致病性,不激活原癌基因.);4单纯疱疹病毒(HSV)载体介导法(可感染非分裂细胞,对感染细胞产生毒性,HSV的感染往往会导致非神经性宿主细胞蛋白质翻译的关闭和mRNA的降解.);5脂质体介导法(利用阳离子脂质体单体包埋外源DNA,通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内.);6直接注射法(将裸露基因DNA直接注入或将DNA团块植入肌肉或某些器官组织.);7受体介导基因转移法(受体介导的细胞内吞作用,具有细胞,组织或器官专一性.);8其它方法(磷酸钙共沉淀法,电穿孔法,细胞核显微注射法,基因枪颗粒轰击法等.).第六题第二问增加或减少基因的拷贝数调控mRNA稳定性高表达载体有高效的启动子