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1第三章芽孢杆菌生物学特性第一节芽孢杆菌形态特征一、概述芽孢杆菌属于细菌。从细菌的形态特征上看，有三种常见形状，即球状、杆状和螺旋状。分别称为球菌、杆菌和螺旋菌；杆菌最多，球菌次之，螺旋状细菌最少。球菌（coccus,复数为cocci），球状的细菌；据细胞的分裂面和子细胞分离与否有不同的排列状态，包括了单球菌（尿素微球菌）、双球菌（肺炎双球菌）、链球菌（酿脓链球菌、溶血链球菌）、四联球菌（玫瑰色微球菌、四联微球菌）、八叠球菌（藤黄八叠球菌）、葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）。螺旋状细菌（有人称为螺菌，spirillum,复数为spirilla）；螺旋状的细菌包括了弧菌（vibrio），螺旋不到一周，菌体呈弧形或逗号状，霍乱弧菌；螺菌，螺旋1-6周，外形坚挺的螺旋状细菌，红螺菌；螺旋体(spirochaete)，螺旋6周以上，由原生质柱、轴丝、外鞘组成，柔软易曲的螺旋状菌体；钩端螺旋体，梅毒密螺旋体。杆菌（bacillus,复数为bacilli）；杆状的细菌，形态多样，包括了短杆状，短杆菌或球杆菌（甲烷短杆菌属）；长杆或棒杆状，长宽差别较大（枯草杆菌、北京棒杆菌、白喉棒杆菌）；梭状，两端稍尖，（梭菌属：鼠疫巴斯德氏菌）；分支杆状，有分支（结核分支杆菌）；平截杆状：两端平截（炭疽芽孢杆菌）。特殊形状的细菌，菌体分叉，双歧杆菌；菌体末端有柄，柄杆菌；菌体有附器，臂微菌。细菌大小一般用显微测微尺测量，单位为微米（μm）1μm＝10-3mm＝10-6m。病毒多用纳米（nm）为单位，1μm＝103nm。细菌的大小不一，球菌直径0.5-2μm，杆菌1-5×0.5-1μm，螺旋菌大小差别较大。大肠杆菌平均长2μm，直径0.5μm，150个大肠杆菌细胞头尾相接等于3mm长的一粒芝麻；120个大肠杆菌捆在一起才有一根头发粗细（人发平均直径60μm），109个大肠杆菌才有1mg重。尽管芽孢杆菌形态简单，细胞大小差异也不很大，然而，芽孢杆菌的形态特征和细胞大小是分类学的重要特征，是芽孢杆菌分类单元的实物载体，研究芽孢杆菌生物学必须描述的内容。二、芽孢杆菌细胞形态芽孢杆菌属于耗氧菌，能耐酸、耐盐、耐高温。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶活性，还有平衡和稳定乳酸菌的作用。此类菌在动物肠道微生物菌群中仅少量存在。目前应用菌种是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。芽孢杆菌存在两种形态：芽胞和营养体。营养体的细胞基本形态有杆状和椭圆状。杆状中有长杆状、短杆状，椭圆状中有长椭圆和短椭圆，如下图。2长杆状（Bacillusclausii）短杆状（Bacillusfirmus）椭圆状（Bacillusendophyticus）BacillusamyloliquefaciensBacillusbenzoevoransBacilluscereusBacillusclausii3BacillusendophyticusBacillusfirmusBacillusflexusBacillusgibsoniiBacilluslentus4BacillusmojavensisBacilluspumilusBrevibacillusbrevis三、芽孢杆菌芽孢形态1、芽孢的定义，有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。1个细菌细胞只形成1个芽孢，有的在细胞一端，有的在细胞中部。由于芽孢是在细胞内形成的，所以也常称之为内生孢子，亦称芽孢。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。2、芽孢的形态，在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。在有些细菌中，芽孢的直径小于菌体直径，这些细菌称为芽孢杆菌，为好氧细菌；在另一些细菌中，芽孢的直径大于菌体直径，使整个菌体呈梭形或鼓塑形，这些细菌称为梭状芽孢杆菌，为厌氧菌，梭状芽孢杆菌的芽孢位于菌体中间。破伤风杆菌的芽孢位于菌体的一端，使菌体呈鼓槌状。好氧芽孢杆菌属(Bacillus)和厌氧的梭状芽孢杆菌属(Clostridium)的所有细菌都具有芽孢。在球菌和螺菌中，只有少数种类有芽孢，球菌中只有芽孢八叠菌（Sporosarcina）属产芽孢。弧菌中只有芽孢弧菌属(Sporovibrio)产芽孢.5细菌芽孢模式图3、芽孢形成，芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：①核物质融合成轴丝状（杆状）。②在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。③小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。④前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。芽泡形成过程中在化学成分方面也发生很大变化。生芽孢的细胞大量吸收钙离子并大量合成营养细胞中没有的吡啶二羧酸。在成熟的芽孢中，芽孢原生质体含有极高的吡啶二羧酸钙，在新合成的、具有特殊化学构造的外（皮层和孢子衣，有时还有芽孢外壁）中也有这种物质。芽孢的壁含有一种特殊的肽聚糖，所有芽孢基本上都一样，但与营养细胞的细胞壁肽聚糖却不一样。同时，芽孢中还含有一些特殊的蛋白质。4、芽孢的特性，由于芽孢在结构和化学成分上均有别于营养细胞，所以芽孢也就具有了许多不同于营养细胞的特性。芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。同时，芽孢还有很强的折光性。在显微镜下观察染色的芽孢细菌涂片时，可以很容易地将芽孢与营养细胞区别开，因为营养细胞染上了颜色，而芽孢因抗染料且折光性强，表现出透明而无色的外观。研究表明芽孢对不良环境因子的抗性主要由于其含水量低（40％）。且含有耐热的小分子酶类，富含大量特殊的吡啶二羧酸钙和带有二硫键的蛋白质，以及具有多层次厚而致密的芽孢壁等原因。自由存在的芽孢没有明显的代谢作用，只保持潜在的萌发力，称为隐藏的生命。一旦环境条件合适，芽孢便可以萌发成营养细胞。细菌芽孢的特点概要，整个生物界中抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要的指标。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞；产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在光学显微镜下观察（相差显微镜直接观察；芽孢染色）。芽孢的含水率低，38%～40%。芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（dipicolinicacid简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。吡啶二羧酸，以钙盐的形式存在，6钙含量高。在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。含有耐热性酶。芽孢由于有以上四个特点，是芽孢对不良环境如：高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。细菌的营养细胞在70～80摄氏度时10分钟就死亡，而芽孢在120～140摄氏度还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。芽孢不易着色，但可用孔雀绿染色。5、芽孢的耐热机制，渗透调节皮层膨胀学说：芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差皮层的离子强度很高，产生极高的渗透压夺取芽孢核心的水分，结果造成皮层的充分膨胀。核心部分的细胞质却变得高度失水，因此，具极强的耐热性。6、芽胞的萌发，刚形成的芽孢总是处于休眠状态。热处理（如65℃放置几十分钟）可以使芽孢加速活化。低温贮藏也有活化作用，只是较慢。芽孢萌发时首先发生吸胀作用，随之折光性和抗性丧失，继而呼吸作用开始，显出代谢活性，芽孢物质（干重）的30％变为可溶物释出，营养细胞壁迅速合成，最后，新形成的营养细胞从孢子衣里萌发出来。萌发通常有三种方式：赤道脱出，末端脱出，斜出。7、芽孢的本质，芽孢细菌的繁殖都是等分横裂的，一个母细胞产生两个子细胞。在其分裂的过程中并没有芽孢的产生；而巨，当产生芽孢时，一个细菌只产生一个芽孢，并没有数量的增加。一般认为，芽孢是在生长后期、营养物质缺乏时形成的，因而是适应不良环境的产物。但实际上，可能不完全是如此。有人在培养枯草芽孢杆菌时，曾作过追踪观察。结果发现，在接种培养4小时后即有芽孢生成。以后每隔4小时观察一次，芽孢数均呈比例增长。至24小时，约半数产生芽孢；48小时，全部变成芽孢。这种情况表明，在此情形下营养细胞转向芽孢形成有一定的概率。芽孢开始形成不必等到生长后期，更不必等到生长完全停止。因此，芽孢形成既不是细菌生活周期的必经阶段，也不是细菌繁殖的一种形式，又不是一种消极的对环境的反应，而是一个新器官的积极生成。决定芽孢形成的根本原因在于细菌内部，细菌染色体上有控制芽孢形成的基因。细菌在营养生长中，这些基因通常不表达，它们可能被一个阻遏体系所控制，一旦这一阻遏消除，就可导致芽孢形成。有时人们把芽孢与荚膜、鞭毛等并列，统称为细菌的特殊结构，这一称呼也值得商榷。因为在正常生长中的营养细胞本身并没有芽孢，而当芽孢形成后，养细胞就不复存在。虽然在有些菌类，芽孢形成后还有部分菌体残存，但这时的菌体已丧失了营养细胞的作用，不能再象无芽孢时的菌体那样进行生命活动。而荚膜和鞭毛就不同了，它们不影响细菌的生命活动，伴随着营养细胞的生存而存在。因此，把芽孢看成是一种独立的休眠体，是一种积极产生的新的生命形式或新器官，或许是恰当的。8、芽孢的成分，芽孢是微生物的休眠状态，大部分代谢活动停止。营养体是芽孢杆菌的繁殖状态。营养体约30分钟分裂增殖一次，营养、温度、pH等条件的改变会使芽胞和营养体转化。芽胞在适宜条件下一般4-6小时萌发成为营养体。营养体能产酶，目前作为饲料用酶中的很多中酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶等都可由芽胞杆菌产生。绝大多数的芽孢杆菌是一个菌体仅形成一个芽孢，芽孢位于菌体内，由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。还有大量的吡啶二羧酸钙布满整个芽孢。皮层处于核心和芽孢壳之间，含有丰富的肽聚糖。7芽孢壳主要由蛋白质组成；此外，还有少量的碳水化合物和类脂类，可能还有大量的磷。最外层是外壁，其主要成分是蛋白质、一定量的葡萄糖和类脂。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强、对染料不易着色，芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力，这可能与芽孢独具的高含量吡啶二羧酸有关。9、芽孢的作用，分类鉴定不同细菌的芽孢具有不同的特点，从形状、大小、表面特征，直到与菌体的关系等都有不同的表现，因此可以作为分类鉴定的依据或参考。科研材料由于芽孢独特的产生方式，成为研究形态发生和遗传控制的好材料。保存菌种芽孢对不良环境有很强的抵抗力，可以保持生命力达数十年之久，在自然界使细菌度过恶劣的环境，在实验室是保存菌种的好材料。分离菌种芽孢的耐热性有助于芽孢细菌的分离。将含菌悬浮液进行热处理，杀死所有营养细胞，可以筛选出形成芽孢的细菌种类。生物杀虫有些芽孢细菌在产生芽孢的同时，可以产生一种双锥形的结晶内含物，称为伴孢晶体，这是一种蛋白质毒素，可以杀死某些昆虫（特别是鳞翅目）的幼虫。蛋白质晶体的毒性是有高度专性的，对其他动物与植物完全没有毒性。因此，它们便成为一种理想的生物杀虫剂，这种杀虫剂的生产，并不需将蛋白质分离出来，只需培养大量细菌，在其形成芽孢并产生晶体时收获、干燥，