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实验八脂肪酸β-氧化作用一、目的与任务•了解脂肪酸的β-氧化作用•通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方法及其原理二、实验原理在肝脏中，脂肪酸经β氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。问题：为什么要生成酮体，其意义是什么？氧化的生化历程乙酰CoAFADFADH2NAD+NADHRCH2CH2CO-SCoA脂酰CoA脱氢酶脂酰CoAβ-烯脂酰CoA水化酶β-羟脂酰CoA脱氢酶β-酮酯酰CoA硫解酶RCHOHCH2CO~ScoARCOCH2CO-SCoARCH=CH-CO-SCoA+CH3CO~SCoAR-CO~ScoAH2OCoASHTCA乙酰CoA乙酰CoA乙酰CoAATPH20呼吸链H20呼吸链乙酰CoA乙酰CoA乙酰CoA乙酰CoA酮体的生成—肝脏羟甲基戊二酸单酰CoA（HMGCoA）脂肪酸硫解酶2CH3COSCoACH3COCH2COSCoA乙酰乙酰CoAHOOCCH2-C-CH2COSCoA|CH3OH|HMG-CoA裂解酶HMG-CoA合成酶CH3COSCoACoASH--氧化CH3COCH2COOHCH3CHOHCH2COOH乙酰乙酸丙酮--羟丁酸脱氢酶CO2NADH+H+NAD+CH3COCH3脱羧酶CoASH2NaOH+I2NaOI+NaI+H2OCH3COCH3+3NaOICHI3+CH3COONa+2NaOH剩余的碘用标准硫代硫酸钠溶液滴定：NaOI+NaI+2HClI2+2NaCl+H2OI2+2Na2S2O3Na2S4O6+NaI碘仿本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。反应式：问题：为什么说本实验的关键是制备新鲜的肝糜?根据滴定对照与滴定样品所消耗的硫代硫酸钠溶液体积之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、实验器材•5ml微量滴定管•恒温水浴•吸管•剪刀•50ml锥形瓶•漏斗•试管及试管架四、试剂与材料•鲜猪肝：0.5g/ml•0.5%淀粉溶液：0.5g淀粉溶解于水中，定容至100ml•0.9%氯化钠溶液：0.9g氯化钠溶解于水中，定容至100ml•0.5M丁酸溶液：取5ml丁酸溶于100ml0.5M氢氧化钠溶液中•15%三氯乙酸溶液：15g三氯乙酸溶解于水中，定容至100ml•10%氢氧化钠：10g氢氧化钠溶解于水中，定容至100ml•10%盐酸：10ml浓盐酸稀释至100ml•0.2M碘液：25.4gI2+50gKI定容到1000ml，用标准0.05M硫代硫酸钠标定•标准0.01M硫代硫酸钠：将已标定的0.05M硫代硫酸钠稀释成0.01M•1/15MPH7.6磷酸缓冲液：1/15MNa2HPO486.8ml+1/15MNaH2PO413.2ml五、操作步骤•肝糜制备：取肝用0.9%NaCl冲洗污血，用滤纸吸去表面水分。称肝组织5g置研钵中，加少量的0.9%NaCl研成细浆。再加0.9%NaCl到总体积10ml。•取2个50ml锥形瓶，各加入3ml1/15M磷酸盐缓冲液（pH7.6）。其中一个锥形瓶中加2ml正丁酸，另一个锥形瓶中不加正丁酸（对照）。再各加入2ml肝糜。混匀于43℃恒温水浴内保温1.5小时。•取出锥形瓶，各加入3ml15%三氯乙酸，混匀，对照瓶内追加2ml正丁酸，混匀，静置15min。分别过滤，滤液收集在2支试管中。•酮体测定：吸取两种滤液各2ml分别放入另2个锥形瓶中，各加3ml0.1M碘液和3ml10%NaOH。摇匀，静置10min。加入6ml10%盐酸中和。•用0.01M标准硫代硫酸钠滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加入3滴0.1%淀粉作指示剂。摇匀，滴至蓝色消失为止。记录所消耗的硫代硫酸钠液的ml数。问题：15%三氯乙酸的作用是什么?肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（A—B）*CNa2S2O3*1/6*5A：滴定对照所消耗的0.01M硫代硫酸钠溶液的ml数B：滴定样品所消耗的0.01M硫代硫酸钠溶液的ml数CNa2S2O3:标准硫代硫酸钠溶液的浓度（M）1/6：1mol标准硫代硫酸钠相当于丙酮的量六、结果计算七.课后研讨题•1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。•2、酮体为什么只能在肝外组织进行作用？•3、什么叫酮体？为什么正常代谢时产生的酮体含量少？在什么情况下血中酮体含量增高，而尿中也能出现酮体？•4、为什么测定碘仿反应中剩余的碘可以计算出样品中的丙酮的含量？•5、查阅资料，介绍在哪些情况下会促进脂肪酸的氧化?。•6、查阅资料，介绍酮体检测的方法，参考值及临床意义？八、汇报要求•以大组为单位课后总结结果，讨论，制作一份ppt，课内讨论汇报。•ppt内容包括：实验目的，实验条件的选择，各小组实验结果，计算结果和分析，课后研讨题，实验体会等。