2011级细胞生物学实验讲义

2011级细胞生物学实验讲义实验一细胞膜通透性观察一、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。2.了解溶血现象及其发生机制。二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。细胞膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，并非所有的物质都能通过。各种物质出入细胞的方式是不同的，带电的物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性，因此带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散。各种非电解质进入细胞的快慢，决定于分子量的大小和极性。相对分子质量大的物质进入细胞慢，非极性分子比极性分子容易穿膜。在细胞膜上有专门的水通道-水孔蛋白、和运输特定物质的载体蛋白，它们的运输方式为易化扩散。水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，分子进入红血细胞，导致水的摄入，使细胞膨胀、破裂发生溶血。溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量有关，相对分子质量大的进入细胞慢，发生溶血所需的时间也长。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。二、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、秒表。2、材料：含适量阿氏液的鸡血或兔血。3、试剂：(1)各种待测溶液：1mol/L乙二醇水溶液、1mol/L丙三醇水溶液、1mol/L葡萄糖水溶液、3mol/L甲醇、3mol/L乙醇、3mol/L丙醇、1/8mol/L、1/10mol/L、1/12mol/Lmol/L葡萄糖水溶液、1/8mol/L、1/12mol/L、1/16mol/LNaCl溶液。(2)阿氏液（Alsever液）,配方如下：枸橼酸钠(Na9C6H5O7.2H2O)……………………………….0.80g枸橼酸（C6H6O7.H2O）…………………………………..0.325g葡萄糖……………………………………………………2.05g氯化钠…………………………………………………….0.42gH2O………………………………………加至100.00ml混匀溶解后，114.3℃高压灭菌，10min备用。阿氏液即含有枸橼酸钠抗凝剂，又含有细胞生存的营养，所以它即可做细胞的抗凝剂，又可做细胞的保存液。阿氏液和采血量为1：1，一般在4℃下红细胞可保存2周其活性和特性不变。三、方法与步骤取12支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各2ml，作出标记后，各管均加入红细胞悬液2滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。四、观察结果1.试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红细胞完好呈双凹盘状。2.如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分红细胞呈碎片。3.如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎片。五、注意事项1、试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。2、红细胞和测试溶液混匀后，应静置于温室中，不要再次摇动，避免人为的分层浑浊。六、作业附表：各种溶液的溶血现象观察结果编号待测溶液是否溶血时间分析原因11mol/L乙二醇水溶液21mol/L丙三醇水溶液31mol/L葡萄糖水溶液43mol/L甲醇53mol/L乙醇63mol/L丙醇71/8mol/L葡萄糖水溶液81/10mol/L葡萄糖水溶液91/12mol/L葡萄糖水溶液101/8mol/LNaCl溶液111/12mol/LNaCl溶液121/16mol/LNaCl溶液目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－七、思考题为什么所有带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散？八、课后习题（一）概念题1、渗透作用:水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透2、溶血:将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。（二）选择填空题1、将红细胞放在低渗盐溶液中，会发生（）A、水分子流出细胞B、水分子既不进入，也不流出细胞C、水分子流入、流出细胞的速度相等D、溶血2、将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，会发生（）A、水分子流出细胞B、水分子既不进入，也不流出细胞C、水分子流入、流出细胞的速度相等D、溶血（三）填空题1、将红细胞放在低渗盐溶液中，会发生（）。2、将红细胞置于乙二醇、丙三醇、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量有关，具体为（）。（四）问答题1、为什么所有带电荷的分子（离子），不管多小，都不能自由扩散？2、为什么把红细胞放入葡萄糖高渗液中也会发生溶血？3、为什么把红细胞放入低渗或某些等渗的盐溶液中会发生溶血？（五）分析题1、水能使血红细胞发生溶血，而且几乎瞬时的，试从细胞物质运输的机制的角度分析这一现象产生的原因。2、等渗的草酸铵和氯化铵均能使红细胞发生溶血，但草酸铵使红细胞发生溶血的速度比氯化铵要快，试从化学物质电离平衡和细胞物质运输的机制的角度分析这一现象产生的原因。实验二线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的1、观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态数量与分布；2、学习一些细胞器的超活染色技术。二、实验原理活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染二类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶体固定，堆积在细胞内的某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的电化学特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳粒子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是有阴离子或阳离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂使用，应选择那些对细胞无毒性或毒性较小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适合，可能是因为它具有溶解在类脂类(卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于细胞吸收。但不是任何染料都可作为活体染色剂使用,一般应选择那些毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用。詹纳斯绿Ｂ这种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对对线粒体进行活染,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的基团。从20世纪初到30年代，法国细胞学家Guilliermond、Dangeard和Parat用活体染色的方法，研究了植物和动物的液泡，提出了液泡系这个名词。当时认为凡是用活体染色的方法，能染上中性红的小泡都属于液泡系。而染不上的小泡被称为圆球体。现在认为在细胞内，凡是由膜所包围的小泡或液泡，除线粒体、质体外，都属于液泡系，包括圆球体。中性红为弱碱性染料，对高尔基液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，这可能是与液泡系中蛋白质有关。三、实验仪器、材料和试剂1、仪器、用具：显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸。2、材料：洋葱鳞茎、人口腔上皮细胞3、试剂：1）Ringer溶液氯化钠０.８５g（变温动物用0.65g）氯化钾０.２５g氯化钙０.０３g蒸馏水1００ml2）1%和1/3000中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50mlRinger液,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤,装入棕色瓶中于暗处保存。临用前，取1%原液1ml加入29mlRinger溶液,即得1/3000工作液,将其装入棕色瓶中备用。3）1%和1/5000詹纳斯绿Ｂ溶液称取0.5g詹纳斯绿Ｂ溶于5mlRinger溶液中,稍加热(30-40℃)溶解,用滤纸过滤后（可省略）,即为1%原液。取1%原液1ml加入49mlRinger溶液,即得1/5000工作液,将其装入棕色瓶中备用.最好现配现用,以保持充分的氧化能力。四、方法与步骤（一）液泡系的活体染色与观察1、口腔上皮细胞的液泡系活体染色观察1)用牙签的钝的一头刮取口腔黏膜，放入载玻片上1/3000中性红染液滴中，染色5－10分钟。2)用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。3)在高倍镜下可见口腔上皮细胞为扁平、不规则形，细胞核及核仁清楚可见，在细胞核上方胞质中，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状体，这一特定区叫“高尔基区”，即液泡系。2、植物细胞液泡的活体染色1）撕取洋葱鳞茎内表皮，放入载玻片上1/3000中性红染液滴中，染色5－10分钟。2）用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。3）可见到被染成砖红色的中央大液泡。（二）线粒体的活体染色与观察1、动物细胞线粒体活体染色的观察1)滴1－2滴1/5000詹纳斯绿B，用牙签的钝的一头刮取口腔黏膜，涂片，加盖玻片，染色10分种后观察。3）镜检：可见口腔上皮细胞中的线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布特别多、大。2、植物细胞线粒体的活体染色1）用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴在干净的载玻片上，用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于染液中，染色10－15分钟。2）吸去染液，加一滴Ringer液，盖上盖玻片，镜检。在高倍镜下，可见表皮细胞中央被一大液泡占据，细胞核被挤至旁边，线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状。五、观察注意事项1、线粒体具有折光性。2、线粒体在细胞的分布常不均匀。六、结果与分析1、简述线粒体詹纳斯绿B活体染色的原理。2、绘出口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布。七、课后习题（一）概念题（每题5分）1、超活染色2、液泡系3、活体染色4、圆球体（二）选择填空题（每题1分）1、詹纳斯绿Ｂ专一性地对对线粒体进行活染是由于线粒体内的()的作用。A、细胞色素氧化酶系B、氧化磷酸化C、质子驱动力D、pH差2、液泡系中（）能被中性红染色。A、高尔基液泡B、活细胞中所有液泡C、植物细胞中所有小泡D、圆球体（三）填空题（每空2分）1、活体染色剂选择那些（⑴）染料，而且总是要（⑵）来使用。2、活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料（⑶）起重要作用。3、中性红对（）的染色有专一性，而且只将（）染成红色（四）问答题（每题10分）1、为什么詹纳斯绿B能专一性地对线粒体染色？2、詹纳斯绿B能染死细胞吗？为什么？3、为什么活体染色剂一般应选择那些毒性小的碱性染料并配成较稀的溶液来使用？实验三胞间连丝的观察一、实验目的观察植物细胞的胞间连丝，了解其意义。二、实验原理胞间连丝是高等植物之间贯穿细胞壁、沟通相邻细胞的细胞质连线。为细胞间物质运输与信息传递的重要通道。胞间连丝与动物细胞的间隙连接有许多相同之处。正常情况下它允许1000道尔顿以下的分子渗透，也能让离子自由通过。与间隙连接不同的是,胞间连丝的孔能够扩张，允许大分子，包括蛋白质和