20120911海洋生物制品学第十二章

第十二章重组细胞因子第一节概述在机体免疫应答活动中，有多种细胞因子参与，如白介素、肿瘤坏死因子等，它们作为免疫活性细胞因子间相互作用的介质，对免疫应答的发生、调节及效应等均起到十分重要的作用。细胞因子（cytokine）的研究对免疫应答及免疫调节免疫细胞之间的信息传递和相互关系等有重要意义，是当今免疫学、遗传学、细胞学以及分子生物学研究最活跃的领域之一。一、细胞因子和重组细胞因子的概念和作用1.细胞因子2.重组细胞因子二、细胞因子的发展历程三、细胞因子的研究近况P303表12-1目前我国批准上市的基因工程细胞因子药物四、几种常见的细胞因子1.干扰素2.集落刺激因子3.促红细胞生成素4.白细胞介素P305表12-2IL-33的结构和功能5.肿瘤坏死因子6.趋化因子7.生长因子第二节细胞因子及其受体的结构和功能一、细胞因子的结构细胞因子种类繁多，不同细胞因子之间在结构上有很大差异，但大多数细胞因子的化学本质为小分子的分泌型多肽,一般分子质量不超过60kDa，多由100个左右的氨基酸组成。少数细胞因子能以与膜结合的形式存在于细胞表面。多数细胞因子以单体形式存在，少数细胞因子以双体形式存在。二、细胞因子受体的结构细胞因子只有同细胞表面的特性受体相结合才能发挥生物学效应。因此对细胞因子受体及结构的研究是十分必要的。由于大多数细胞因子受体基因已克隆成功，因此目前对其结构和信息传递也已有初步了解。P308表12-3细胞因子受体的结构特征三、细胞因子的生物学活性细胞因子种类繁多、结构复杂，这是它具有广泛的生物学活性的基础，它能促进靶细胞的增殖和分化，增殖抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。细胞因子的作用具有“多相性”和“网络性”的特点，即每种细胞因子可与多种免疫细胞或非免疫细胞作用，每种免疫细胞可受多种细胞因子的调节，不同细胞因子之间具有相互协同或相互制约的作用，细胞因子本身受到体内多种因素的影响，由此构成了复杂的细胞因子免疫调节网络。众多的细胞因子生理活性的发挥具有以下共同的作用特点。（1）绝大多数细胞因子为分子质量小于25kDa的糖蛋白，分子质量低者如IL-8仅8kDa。多数细胞因子以单体形式存在，少数细胞因子如IL-5、IL-12、M-CSF和TGF-β等以双体形式发挥生物学作用。大多数编码细胞因子的基因为拷贝基因（GOES）（INF-α），并由4～5个外显子和3～4个内含子组成。P310表12-4细胞因子可能导致的病理反应五、几种重要的细胞因子及其受体的分子结构和功能1972年Gery等发人白细胞培养的上清液中含有一种可溶性物质，这种物质可促进小鼠胸腺细胞对植物血凝素（PHA）的有丝分裂反应。起初命名为淋巴细胞激活因子（lymphocyte-activatingfactor，LFA）或内源性热原质（endogenouspyrogen）、破骨细胞激活因子（osteoclastactivatingfactor）、黑色素瘤细胞生长抑制因子（melanomagrowthinhibitoryfactor)等。在1979年第二节国际淋巴因子专题讨论会上，将这些来自单核-巨核细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节和在炎症反应中起作用的因子称为白细胞介素（interleukin，IL）。目前已知许多IL是来自单核-巨噬细胞和淋巴细胞以外的其他细胞。（一）白细胞介素-1（IL-1）及其受体（IL-1Rt）的分子结构和活性1.白细胞介素-1的分子结构和基因2.IL-受体T细胞、成纤维细胞表面IL-1受体为80kDa，而B细胞则为68kDa。编码这两种IL-1受体是不同基因产物。p80IL-1RⅠ（CDw121a），p681IL-1R称为IL-1RⅡ（CDw121b）。（1）IL-1RtⅠ（2）IL-RtⅡ3.IL-1的主要生物学作用IL-1具有广泛的免疫调节作用，并有致热和介导炎症的作用，它的生物学功能是通过与相应高亲和力受体结合而介导的，IL-1生理条件下的浓度仅在1410～1210mol/L之间。IL-1作用无明显的种属特异性。IL-1主要有下述生物学作用。（1）促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化（2）促进B细胞的功能（3）刺激骨髓多功能干细胞的增殖（4）增强NK细胞的杀伤活性（5）促进多种免疫分子的基因表达（6）刺激单核细胞核巨噬细胞产生细胞因子（二）白细胞介素-2（IL-2）及其受体（IL-2R）的分子结构和活性1976年Morgan等发现丝裂原刺激的小鼠脾细胞培养上清液中含有一种刺激胸腺细胞生长的因子，由于这种因子能促进和维持T细胞长期培养，称为T细胞生长因子（Tcellgrowthfactor，TCGF），1979年统一命名为白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）。1.IL-2的分子结构和基因2.IL-2受体IL-2受体是由α、β、γ三条链组成（1）IL-2受体的α链（2）IL-2受体的β链（3）IL受体的γ链（4）可溶性IL-2受体3.IL-2的生物学作用（1）刺激T系细胞并产生细胞因子（2）诱导杀伤细胞产生细胞因子（3）刺激和调节B细胞，活化巨噬细胞（三）多重集落刺激因子（IL-3）及其受体（IL-3Rt）的分子结构和活性1981年Ihle等发现ConA刺激小鼠脾细胞的培养上清液中含有一种因子，能提高裸鼠脾脏成熟淋巴细胞标志20-α-羟固醇脱氢酶的阳性率，命名为白细胞介素-3（interleukin-3，IL-3）可刺激多功能干细胞和多种祖细胞的增殖与分化，又称为多种集落刺激因子（multi-CSF）。1.IL-3的分子结构和基因2.IL-3的受体2.IL-3的生物学作用（四）促进细胞生成素（EPO）及其受体（EPORt）的分子结构和活性1.EPO的分子结构和基团2.EPO的受体3.EPO的生物学作用（五）趋化因子（IL-8）及其受体（IL-8Rt）的分子结构和活性由组织细胞和微生物产生的趋化剂（chemoattracatans）对白细胞的趋化作用（chemotaxis）是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体防御和清除入侵病原体等异物先天性免疫功能的一个重要方面。1986年以前，“经典”（classical）的白细胞趋化物质主要有补体片段C5a、白三烯L4（leikotrinin，LTB4）、血小板激活因子（piatelet-activatingfactor，PAP）、和fMLP（N-formyimethionyl-lecucyl-alanine，N-甲酰甲硫胺酰-亮氨酸-苯丙氨酸）、这些趋化物质的受体同属于G蛋白偶连体（GTP-bindingroguiacoryproteinreceptor）。1988年IL-8基因克隆成功后，已形成了称为趋化因子（chemokine）的一个家族。到目前为止，趋化因子家族的成员有7个穿膜区受体家族（sevenpredicatedtransmembranedomainreceptorsuperfamily，STRsuperfamily）。1.IL-8的分子结构和基因2.IL-8受体3.IL-8的生物学作用（1）作用于中性粒细胞（2）作用于嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞（3）作用于T淋巴细胞核NK细胞（六）肿瘤坏死因子（TNF）及其受体（TNFRt）的分子结构和活性TNF是Carswell和Oldy于1975年首次发现，小鼠经卡介苗（BCG）注射和内毒素坏死的因子，称为肿瘤坏死因子（TNF）。血清中含TNF有两种形式：TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素α（lymphotoxin，LT-α）命名为TNF-β。TNF-α又称恶液质素。1.TNF的分子结构和基因（1）人的TNF-α基因长约2.76kb，小鼠为2.78kb，结构非常相似，均由4个外显子和3个内含子组成，与MHC基因群紧密连锁，分别定位于第6对和第17对染色体上。1984年从HL60、U937等细胞中成功克隆rHuTNF-αcDNA，并在大肠杆菌中获得高表达。人TNF-α前提由233个氨基酸残疾组成，含76个氨基酸残疾的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-α为157个氨基酸残疾，非糖基化，第69位和第101位两个版膀胱氨酸形成分子内二硫键。rHuTNF-α分子的质量为17kDa。小鼠TNF-α前提为235感染氨基酸残疾，信号肽含79个氨基酸残基，成熟的小鼠TNF-α（rMuTNF-α）分子质量为17kDa，由156个氨基氮残基组成，第69位和第一百位两个膀胱氨酸形成分子内二硫键，有一个糖基化点，但糖基化不影响其生物学功能。rHuTNF-α与rMuTNF-α有79%氨基酸组成具同源性，TNF-α-TNF-α的生物学作用似无明显的种属特异性。最近有人报道通过基因工程技术表达了N端少2个氨基酸（Val、Arg）的155个氨基酸的人TNF-TNF-α，具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。此外，还有用基因工程方法，将TNF-TNF-α分子氨基端7个氨基酸残基缺失，再将8位Pro、9位Ser和10位Aap改为8位，Arg、9位Lys和10位Arg，或者再同时将157位Leu改为157位Phe，改构后的TNF-α比天然TNF-α和TNF-β发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。（2）人和小鼠TNF-Β基因分别定位于第6位和第17号染色体。HuTNF-β分子由205个氨基酸残基组成，含有34个氨基酸残基的信号肽，成熟型HuTNF-β分子为171个氨基酸，分子量25kDa。rMuTNF-β分子由202个氨基酸组成，包括33个氨基酸残基的信号肽，成熟分子为169个氨基酸残疾，与HuTNF-β有79%的同源性。HuTNF-β与HuTNF-αDNA序列达56%，氨基酸水平上同源性为36%。2.TNF受体（1）TNFR的分型（2）可溶性TNFR3.TNF的生物学作用（1）杀伤或抑制肿瘤细胞①直接杀伤或抑制作用TNF与相应是受体结合后向细胞内移动，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解。也有认为TNF激活磷脂酶A2，稀释超氧化物而引起DNA断裂，磷脂酶A2抑制剂可降低TNF的抗病效应。TNF可变靶细胞代谢，使细胞内pH降低，导致细胞死亡。②调节机体免疫功能通过TNF对机体免疫功能的调节作用，促进T细胞及其他杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤。③作用于血管内皮细胞TNF作用于血管内皮细胞，损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱，使血管损伤和血栓形成，造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、缺氧坏死。（2）促进中性粒细胞的吞噬、黏附作用和相关抗原的表达（3）抗感染（4）引起发热，诱导特殊情况下蛋白质合成（5）诱导髓样白血病细胞分化（6）促进细胞增殖、分化和相关基因表达（七）干扰素（INF）及其受体（INFRt）的分子结构和活性1957年Isaacs和Lindermann首先发现了病毒干扰现象，即病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其他细胞干扰病毒的复制，因而命名为干扰素。目前已知干扰素并不能直接杀伤病毒，而是诱导宿主细胞产生数种酶，干扰病毒的基因转录或病毒蛋白质组分的翻译。根据产生干扰素细胞来源不同、理化性质和生物活性的差异，可分为α-干扰素（interferon-α，IFN-β）、β-干扰素（interferon-β，IFN-β）和Y-干扰素。1.IFN-α/β的分子结构和基因2.IFN-α/β的受体3.IFN-α/β的生物学作用（1）抗病毒作用（2）抑某些细胞的生长（3）免疫调节作用（4）抑制和杀伤肿瘤作用IFN-α/β杀伤肿瘤细胞主要是通过促进机体免疫功能，提高巨噬细胞、NK细胞核CTL的杀伤水平。不同的IFN-α亚型的诱生、抗病毒和免疫活性可有所不同，例如，①同一病毒在不同细胞中诱生IFN-α亚型种类有很大差异。（八）转化因子-β（TGF-β）及其受体的分子结构和活性转化因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。这一家族除TGF-β外，还有活化素（activins）、抑