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丝状真菌中获得重组蛋白——我们是否期待太多？Makingrecombinantproteinsinfilamentousfungi-areweexpectingtoomuch?HelenaNevalainen*andRobynPeterson文献来源：frontiersinMICROBIOLOGY2014，5（75）：1-10摘要用于重组蛋白生产的宿主是为特殊目的选择的典型高蛋白分泌突变菌株，例如纤维素降解酶的高效生产。然而，令人吃惊的是，对被广泛应用于重组基因表达的宿主，对水解纤维素的里氏木霉的一系列突变菌株进行基因组测序，结果几乎没有阐明促进高水平蛋白分泌方面性质的改变。虽然普遍认为和表明，丝状真菌的蛋白分泌主要发生在菌丝末梢顶端，越来越多的证据显示蛋白分泌同样可以发生在接近顶点的区域。利用细胞分子伴侣和折叠酶的共表达来尝试促进正确折叠以增加异源蛋白的产量已经获得很多成功；转录水平上的潜在原因已经被主要研究。真菌菌株中所观察到生理变化，即通过强启动子过表达蛋白带来压力增加，同样反映了宿主所面临的挑战。很明显，和其它真核生物一样，真菌内质网是一个高度动态结构。综合考虑，研究利用较弱表达启动子来阻止过度压力是一种新兴工作。丝状真菌被认为是用于生产治疗用途药学蛋白的候选者。就真菌生产异源基因产物而言，其中一个最大的挑战是它们的糖基化模式；真菌缺少哺乳动物中发生的功能重要的聚糖末端唾液酸化作用。最后，共同研究复杂的发酵工艺以及代谢路径和通量或许可以得出新的策略来在丝状真菌中生产重组蛋白。关键词：丝状真菌，重组蛋白，表达，分泌，里氏木霉前言作为自然界顽固聚合物的腐食生物，丝状真菌，例如水解纤维素的里氏木霉，被认为是生长菌丝外蛋白的优秀分泌者。多年来，这个特性已经被提高到工业生产菌株能够在优化发酵条件下分泌100g/L同源蛋白到培养基中的程度（CherryandFidantsef,2003）。因为这些水平远好于其他生物，丝状真菌有希望是工业规模重组蛋白的最大生产菌株。朝着这个目的，目前进行内部蛋白质量控制，分泌压力，蛋白表达和分泌相关的基因组学，翻译后蛋白的修饰，选择性表达启动子的应用，特别转录因子的识别以及真菌生理机制和生产力的联系这些方面细胞机制上的研究（reviewedinPuntetal.,2002;Meyer,2008;LubertozziandKeasling,2009;Sharmaetal.,2009;FleissnerandDersch,2010;SchusterandSchmoll,2010;Ward,2012）。分子方法，例如密码子优化以及融合一个同源高分泌蛋白来表达外源蛋白，已经成为真菌实验室的常规方法（(Conesaetal.,2001;Nevalainenetal.,2004）。除了产量，异源蛋白以活性/功能形式产生同样重要。丝状真菌分泌的蛋白在分泌途径中由折叠、蛋白水解、添加多糖基团进行修饰，其中添加多糖基团是主要的修饰方式。关于在丝状真菌中生产起源于哺乳类生物的有功能重组蛋白，最关键的修饰可能是糖基化，因为其可能影响蛋白的功能、血清半衰期和免疫原性。丝状真菌中糖基化的主要模式是高甘露糖类型，添加的糖并没有哺乳动物细胞中发生的并且功能重要的多糖糖链末端唾液酸化特征（Brooks,2004;Deshpandeetal.,2008;DePourcqetal.,2010）。这一领域的潜在发展将在下面讨论。实验证据表明，由于不正确过程、修饰或错误折叠导致其在细胞质量控制机制中被除去，丝状真菌表达的外源蛋白丢失或困在分泌路径中（(ArcherandPeberdy,1997;Goukaetal.,1997）。这些机制的遗传学、转录组学和蛋白组学研究揭示了这个过程中的一些基因和调节循环（Chapmanetal.,1998;Pakulaetal.,2003;Al-Sheikhetal.,2004）。这个知识促生了一系列文献，其中包括在黑曲霉中和感兴趣的蛋白一起过表达编码细胞折叠酶和分子伴侣的基因（seeNevalainenetal.,2004）。这个结果在“没有影响”（例如，和牛凝乳酶共表达的prpA；WangandWard,2000）到和植物甜蛋白共表达的pdiA产量提高五倍间发生变化（Moralejoetal.,2000）。已经发表的例子太少以至于不能得到更广泛的结论，但是其表明在丝状真菌中异源真菌蛋白的产量比源于哺乳类的蛋白有更好的机会得到提高；这在没有分子伴侣促进的异源蛋白上同样正确。工业应用丝状真菌的典型生命循环包括营养菌丝，可发育产生新菌丝的无性孢子，或很少的，经减数分裂形成的无性孢子。蛋白主要通过正在生长菌丝的顶端分泌，这致使生长和蛋白分泌紧密相连，以致于很难独立研究（Wessels,1993）。迅速生长菌丝中的运输机制需要高效工作来确保生长所需的细胞壁材料能够在菌丝顶端得到利用，这个功能同样和胞外蛋白分泌相关。丝状真菌中有很多生长速率和蛋白分泌相关的例子，例如，米曲霉生产α-淀粉酶（Spohretal.,1998;CarlsenandNielsen,2001）和黑曲霉生产葡糖淀粉酶（Schrickxetal.,1993;Withersetal.,1998;Pedersenetal.,2000）。里氏木霉恒化培养下的低生长速率和胞外蛋白产量增加相关。然而，当大量碳源消耗用于维持细胞需求时，蛋白产量在非常低的生长速率时降低（Pakulaetal.,2005）。同样有证据表明，饥饿会诱导酶分泌作为真菌寻找食物的探索（Gongetal.,1979；Machetal.,1999）。这些发现强调了调节培养因素来创造支持蛋白生产生理条件的重要性。转化DNA通常整合作为真菌基因组的一部分，因为菌丝生长和单核以及多核无性孢子形成间的选择使它很难维持大量自主复制质粒，例如，来增加基因拷贝数进而提高产量。说了这些，一些真菌拥有自主复制序列（ARS）成分（e.g.Fusariumoxysporum,PowellandKistler,1990;A.Nidulans,Gemsetal.,1991;AleksenkoandClutterbuck,1995,1997;Phanerochaetechrysosporium,RaoandReddy,1984;andAshbyagossypii,Schadeetal.,2003），其可能通过增加基因拷贝数增加产量。最近，棉阿舒囊霉作为重组蛋白潜在产生宿主的介绍使这些因素受到瞩目（Ribeiroetal.,2010,2013;Ribeiro,2012）。丝状真菌占主导地位，因为重组蛋白菌株是无性生产菌株黑曲霉、米曲霉和里氏木霉。结果，大多数关于异源蛋白表达的信息来自于使用这些特别真菌以及遗传特征明显的构巢曲霉。最近一个关于生产同源和异源重组基因产物的竞争者是并矢国际公司（Jupiter,FL,USA）开发的热带金孢子菌。热带金孢子菌的优势是高转化频率，蛋白产物的pH值为中性，特别菌株所需粘性培养基以及培养时间短（Puntetal.,2001;Emalfarbetal.,2003）。这篇文章中，我们将关注围绕里氏木霉开展的工作，并相对简单地转移到其它相关菌株。尽管大量工作有利于这个主题和新技术的快速发展，但是，在过去几十年，在推动异源基因产物量达到同源蛋白水平方面并没有大的突破。所以，我们错过了什么，接下来该往哪走？随机突变的潜在影响首先使用随机突变和筛选方法，最近基因工程的方法，丝状真菌被发展成为高水平酶生产者已经30年（reviewedinNevalainenetal.,2005;Ward,2012）。里氏木霉的菌株改造历史被很好地记录下来（Durandet.al.,1988;PetersonandNevalainen,2012）。因为传统遗传研究不可能或者没有为主要生产菌株所建立，例如，黑曲霉和里氏木霉，即使后者拥有有性生殖状态（红褐肉座菌），并且前者拥有相近的遗传学被熟知的构巢曲霉，高生产菌株遗传组成的精确性质仍然未知直到基因组测序能够使用。例如，和野生型QM6a相比，里氏木霉一系列高纤维素酶生产菌株的基因组测序揭示了遗传组成上的大量变化（Martinezetal.,2008;Seidletal.,2008;LeCrometal.,2009;Vitikainenetal.,2010;reviewedinPetersonandNevalainen,2012;andKubicek,2013;）并且解释了一些观察到的表型和代谢特征；即使这样，蛋白分泌大大提高的基础仍然没有解决。里氏木霉的一些高蛋白生产菌株，例如Rut-C30（MontenecourtandEveleigh,1979），被作为同源和异源基因产物的表达宿主使用（reviewedinMäntyläetal.,1998;PetersonandNevalainen,2012）。这个菌株中高效蛋白（纤维素酶）合成和分泌的一个所提倡的基础是增加内质网的量，其提供更大分泌蛋白合成的空间体积（Ghoshetal.,1982）。这个发现最终导致分泌路径中通过敲除编码主要蛋白基因，就里氏木霉而言，在不同的组合中中丢失这些基因，纤维二糖水解酶I（CBHI/Cel7A)，纤维二糖水解酶II（CBHII/Cel6A)，内切葡聚糖酶I和II（EGI/Cel7BandEGII/Cel5A)，形成“释放”空间的概念（Seibothetal.,1992;Karhunenetal.,1993;Suominenetal.,1993;Wangetal.,2004;Rahmanetal.,2009）。按照这个理论，从分泌路径中消除CBHI能够释放大约60%的空间（Nummietal.,1983;Harkkietal.,1991）。尽管一些情况下操作相对成功，其他一些编码主要分泌蛋白基因的敲除并没有改变分泌重组蛋白的产量（Miettinen-Oinonenetal.,1997）。cbh1基因的敲除由感兴趣基因目标替代内生cbh1基因座完成（e.g.Karhunenetal.,1993;Joutsjoki,1994;Saarelainenetal.,1997;Miettinen-OinonenandSuominen,2002)，这个基因含有从高转录效率基因座表达所需基因的假想优势（e.g.，Karhunenetal.,1993;Joutsjoki,1994;Saarelainenetal.,1997;Miettinen-OinonenandSuominen,2002）。例如，用内生egl1目标替代高水解纤维素菌株VTT-D-79125的cbh1基因座，然后用egl2目标代替cbh1基因座，其导致EGI活力提高4倍（Miettinen-OinonenandSuominen,2002）。很少有曲霉上信息的发表，也许是因为其高商业敏感性。似乎很明显，鉴定个体基因和基因组上的改变将不会为分泌至上的未定问题提供答案。很有可能，答案隐藏在相关基因和蛋白以及它们的调节中。同样，通过随机突变和筛选得到的高纤维素酶分泌里氏木霉菌株或许已经“习惯于”纤维素酶产生和分泌，因此引进一个不同性质的蛋白大量生产和分泌或许不会像它看起来那么简单。考虑到以上因素，首先引入感兴趣的基因，然后应用随机突变和筛选来提高所需蛋白的产量水平似乎很有价值。自动高流量筛选程序将使筛选成千上万突变子逐步可行。棉阿舒囊霉“首先转化，然后筛选”的原则被引进。使用乙基甲硫酸对拥有里氏木霉egl1基因的棉阿舒囊转化子进行随机突变导致蛋白分泌的全面提升以及胞外EGI活性两到三倍提高（Ribeiroetal.,2013）。在转化宿主中，寄希望于包括整个基因组的随机突变实现协同效应来提高感兴趣基因产物的合成和分泌看起来有吸引力。例如，我们没有参与一个基因产物高效分泌的所有基因的信息，即使我们有，目前通过基因转化和失活的目标替代方法以及标记循环的要求会需要大量的努力来处理可能参与这个过程的成百上千的基因。在不久的将来，使用