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细胞工程CellEngineering一、细胞工程在现代生物技术中的地位1.生物技术应用生命科学及工程学的原理和技术，对生物进行控制和改造，以实现人类特殊需求的综合性技术。第一节概述•基因工程•蛋白质工程•酶工程•发酵工程•染色体工程•细胞工程2.生物技术的研究领域基因工程在分子水平上，用人工方法提取、合成或重组不同生物的遗传物质，并通过载体把重组分子引入受体细胞，使其复制与表达,最终实现商业价值的技术。基因工程基本过程转化子筛选载体选择目的基因提取体外DNA重组引入受体细胞重组DNA检测蛋白质工程蛋白质工程就是在对蛋白质结构与功能认识基础上，对蛋白质进行人工改造与合成，最终获得商业化产品的技术。功能检测蛋白质工程的基本过程分离纯化目的蛋白测定氨基酸序列分析蛋白质结构设计编码该蛋白基因分离、纯化蛋白通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并采用各种方法使酶发挥最大催化功能，而应用于社会的一门技术。酶工程酶工程的基本过程分离纯化酶反应动力学测定酶固化酶的修饰与改造酶的生产利用现存微生物和经DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。发酵工程发酵工程的基本过程菌种选育大规模培养活性产物诱导菌体及产物收获染色体工程按照一定设计，有计划地削减、添加和替换同源或异源染色体及某一部分，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的技术。细胞工程是在细胞水平上，采用细胞生物学、发育生物学和分子生物学等理论方法，按人们需要和设计改变或创造细胞遗传特性的综合技术。按照人们的设想，置换细胞质或细胞器。细胞质工程二、细胞工程的理论基础三、细胞工程的研究范围微生物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程转基因生物第二节细胞工程的主要技术一、大规模细胞体外培养二、细胞融合三、细胞核移植四、基因转移根据培养物的不同分为细胞培养、组织培养和器官培养。一、大规模细胞体外培养将活体中取出的组织或细胞，制成单个细胞悬液，并培养于固体基质或培养液中，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。细胞培养将一小片活体组织放在盛有培养液的培养器皿中，使之贴壁生长过程。组织培养使器官原基、一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的技术。器官培养（二）细胞培养概述1.体内外细胞培养的差异和分化失去原有组织结构和细胞形态，分化特性减弱或不显，出现类似“反祖”现象；细胞趋单一化，或获得永生及变成恶性细胞群。体外★排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片★细胞—细胞接触易断开而单独行动★游离的成纤维样细胞，常有细胞突起★很少脱离细胞群而单个活动2.培养细胞分类粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（上皮细胞型和成纤维细胞型）脾、骨髓及白细胞在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团生存空间大，数量多，传代方便，易收获，可获稳定状态悬浮型细胞：不附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下生长的细胞。3.培养细胞形态不稳定性血清高血清-----成纤维细胞样低血清-----上皮细胞样pH太酸或太碱-----成纤维细胞样标准-----上皮细胞样细胞密度低密度-----成纤维细胞样高密度-----上皮细胞样生长状态贴附-----成纤维或上皮样悬浮-----圆形转化未转化-----成纤维细胞样转化-----上皮细胞样Hela3T3（1）贴附（2）接触抑制（3）密度抑制4.培养细胞的生长特点（1）培养细胞生命期指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，包括原代培养期、传代培养期及衰退期。5.培养细胞的生长和增殖原代培养期:也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。特点:细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能上相似性大。传代期:当细胞增殖达到一定密度后，由于生存空间和营养有限，必需分离出一部分细胞和更新营养液，以保持细胞的继续生存，这一过程叫传代。特点:在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。衰退期特点:此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。（2）体外培养细胞生存期(潜伏期;指数增生期;停滞期)细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。6.培养细胞生存所需基本物质（1）糖（2）氨基酸（3）维生素（4）促生长因子（5）其它物质（三）大规模细胞培养原则使细胞的高密度和高浓度生长，以制备大量细胞或细胞产物的方法，培养容量常在2L以上。1.增加培养容积2.扩大细胞附着面积3.抑制细胞凋亡3.抑制细胞凋亡也称细胞程序性死亡，是指为维持内环境稳定，由基因控制的，细胞自主有序的死亡。凋亡小体大小不等，有完整膜包裹的，内含胞质、细胞器及染色质片段的结构.4.无血清培养基(1)基础培养基(2)生长因子和激素(3)基质（四）大规模细胞培养方法1.悬浮培养系统细胞在培养液中呈悬浮状态生长和增殖的培养方法。优点：◆设备简单，成本低。◆容积可选择性大。◆可连续收集培养细胞和产物进行分析、传代。◆无须消化，防止细胞损伤。◆细胞浓度均一，产量恒定。缺点：◆震荡(避免沉降)。◆不断充气(细胞代谢和气体交换)。◆易产生气泡(添加抗泡沫剂)。2.固定化培养是细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术。吸附法：使细胞在适当条件下贴附在载体表面、中空纤维膜或容器表面的技术。包埋法：将细胞包埋于多聚物等海绵状基质中进行培养的技术。优点：◆细胞可维持在较小体积培养液中生长。◆细胞生长密度较高。◆培养液易于更换。易进行实时分析。3.气流驱动培养系统通过位于中心气流管底部的的喷射装置将混合气体注入容器，使培养物在容器中循环流动培养的技术。优点：◆简化设计，降低成本.◆以气体为循环培养动力，防止机械搅拌损伤.4.微载体培养系统细胞吸附于微载体表面，并借助于搅拌器作用，均匀悬浮于培养液中进行培养的技术优点:扩大细胞附着表面积缺点:微载体之间的相互聚集(蛋白水解酶和适当搅拌力)5.灌注培养系统将细胞培养在能以相同速率自动替换培养液的容器中的技术.优点:◆可使细胞始终处于一个教好的营养状态和生存环境.◆可连续收集培养细胞所分泌的产物.◆可通过改变培养液的组成实现对细胞状态的人为调控.缺点:设备复杂,需大量培养基质,细胞状态不稳,易污染.1)研究对象是活细胞2)研究条件可人为控制3)样本可达到均一4)便于观察、检测和记录5)研究范围广泛6)费用经济1.细胞培养的优点（五）细胞培养技术的应用1)人工模拟条件与体内实际情况不完全相同。2)长期生活在缺乏动态平衡的体外培养环境中,细胞特性将发生变化。2.细胞培养的缺点生物技术上：生产各种生技术产品。狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗、表皮生长因子、干扰素、白细胞介素等进行单克隆抗体制备。科学研究上：病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等。3.细胞培养意义二、细胞融合也称体细胞杂交,指两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的技术。（同核体，异核体）（二）细胞融合的基本原理◆基于酶缺陷型细胞和药物抗性建立筛选◆基于营养缺陷型细胞建立筛选◆由温度敏感型细胞组成的杂种细胞筛选◆具有所需性状的杂种细胞筛选异核细胞：非同源细胞的融合体。同核细胞：两个相同细胞的融合体。多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。2.细胞融合类型根据融合细胞核的类型:3.融合因素仙台病毒紫外线丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）灭活的仙台病毒新城鸡瘟病毒疱疹病毒聚乙二醇4.细胞融合过程2）诱导融合：1）自然融合：(三)细胞融合方法生物法:物理法:化学法:优点:打破了细胞融合的种属屏障。缺点:病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异。1.生物法(仙台病毒法)利用灭活病毒特性促进细胞融合的方法.步骤：★两细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；★病毒作用细胞膜,使两细胞膜及胞质互相渗透；★两细胞核互相融合，细胞融为一体；★细胞正常分裂成含有两种染色体的杂种细胞。2.物理法利用物理条件促进细胞融合的方法.步骤细胞膜接触→膜击穿→膜融合电脉冲诱导在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂并连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。优点：☆融合率高、重复性强、对细胞伤害小；☆装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察融合过程；☆诱导过程可控性强。2.物理法步骤细胞膜接触→膜击穿→膜融合3.化学法利用化学试剂促进细胞融合的方法.盐类融合法高钙和高pH值融合法聚乙二醇融合法(PEG法)聚乙二醇（PEG）法PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在质膜之间形成分子桥，使细胞质膜发生粘连和融合。另外，PEG能增加脂膜的流动性，使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。机理◆分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂,一般分子量低于1000的PEG作融合剂最好。50％PEG溶液能产生最多杂交细胞。PEG溶液在pH=6.0时细胞融合率最高。条件优点:◆易得，用法简单，勿需特殊设备，融合成本低；◆融合易控制,效果稳定,产生的异核率较高；◆融合过程不受物种限制。缺点:◆融合过程繁琐，可能对细胞有毒害。特点步骤细胞混合→PEG处理→膜融合★研究细胞的核质关系★揭示疾病发生的机制★用于基因定位研究★用于动植物育种和植物种质保存★生产单克隆抗体、生物药和疫苗★用于细胞疗法(四)细胞融合的应用★发酵工业优良菌种改良人源单克隆抗体主要困难:（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。（2）杂交瘤抗体产生水平低，且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；（3）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难；（4）人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。问题:1.细胞株的遗传性不稳定2.存在伦理方面的问题前景:1.有望对细胞凋亡、神经系统发生、肿瘤发生、干细胞生物学等生命现象作出诠释,2.可对癌症及传染病进行有效的防护和治疗。3.有望克隆出人类胚胎,用于治疗性克隆研究,4.可通过人类胚胎干细胞,在体外诱导分化,克隆出人体组织和器官。(五)存在问题及医学应用前景利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个去核细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，以获得重组细胞并发育成无性杂交新个体的技术。三、细胞核移植(一)细胞核移植技术的建立(二)核移植技术过程核受体细胞制备核供体细胞制备细胞核移植与激活重组细胞的培养胚胎移入1．核受体细胞的准备去核卵母细胞★激素刺激雌体超排卵★直接吸出滤泡卵丘在体外培养成熟2．核供体细胞的准备供体细胞来源胚胎卵裂球体细胞胚胎干细胞3．细胞核移植与激活胞质内注射（直接）方法透明带下注射（融合）重组细胞移入中间受体作体内或体外培养，发育至桑椹胚或囊胚过程。羊、牛、猪——体内培养大鼠、小鼠和兔——体外培养4．重组细胞的培养5．胚胎移植代孕母体外部特征明显与供体品种不同繁殖性能强体格稍大和健康品种同期发情处理移入子宫个体选择发育(三)核移植技术的应用1．制备转基因动物；2．培育优良畜种，扩大良种种群；3．开展动物克隆，拯救濒危动物；4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆；5．进行生物药物生产；6.研究生物学的基本问题。从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA药物生产(一)基因转移概述将外源基因导入受体细胞,并整合到受体细胞基因组中，使其遗传性状及表型发生一定改变的技术。四、基因转移1.基因转移概念外源目的基因制备外源目的基因有效导入受体细胞筛选携有目的基因细胞2.基因转移过程▲采用限制性内切酶，从生物组织中获取。▲通过mRNA合成cDNA。▲人工合成DNA片段。▲聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。（1）目的基因选择3.基因转移方法（2）目的基因克隆★通过载体在宿主中克隆选择载体目的基因与载体连接重组体导入受体细胞★通过PCR反应克隆（3）目的基因转移电穿孔法显微注射法脂质体包埋法磷酸钙介导DNA共沉淀法病毒介导法（二）转基因动物稳定整合入基因组中的外源基因，能通过生殖细胞传给后代，并发育成完整个体的动物.1.转基因动物概念选择合适的体外培养系统和宿主动物