病毒学检验-第二章-鸡胚和动物接种技术-2015

病毒学检验病毒学检验第二章鸡胚和动物接种技术Chapter2Inoculationtechnologyofembryoandanimal医学检验教研室李文娟病毒学检验病毒学检验2本章内容第一节鸡胚接种技术第二节动物接种技术第三节鸡胚和动物接种技术在病毒检验中的应用病毒学检验病毒学检验掌握鸡胚接种途径及方法、病毒的检测实验动物的种类、实验动物接种途径和接种方法熟悉鸡胚孵育与检查、鸡胚接种所需实验材料与器械实验动物编号和分组、接种后的观察等问题了解鸡胚的解剖与生理；鸡胚和实验动物接种技术在病毒检验中的应用教学要求3病毒学检验病毒学检验4方法应用价值存在问题动物接种应用最早；方法简便；结果易于观察自身带病毒；有的接种后不敏感；动物饲养问题鸡胚培养来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种敏感病毒谱窄细胞培养应用广泛，敏感病毒谱广设备技术要求条件高病毒分离培养常用方法病毒学检验病毒学检验第一节鸡胚接种技术病毒学检验病毒学检验6概况1911年Rous和Murphy首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等应用鸡胚繁殖病毒、Cox应用卵黄囊培养立克次氏体。病毒学检验病毒学检验7鸡胚接种技术的优点鸡胚为一整体，有神经血管的分布及脏器的构造；鸡胚的组织分化程度低，可选择适当途径接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体含大量病毒；来源充足，操作简单，通常是无菌的，对接种的病毒不产生抗体。病毒学检验病毒学检验8鸡胚接种技术的缺点通常不产生特异性的感染指征；食入的抗生素会传递给鸡胚，使病原体在鸡胚中的繁殖受到抑制；某些细菌和病毒能够从感染的鸡传递到鸡胚。病毒学检验病毒学检验9一、鸡胚的结构与生理鸡胚是由外胚层、中胚层和内胚层三个胚层发育起来的，它们共同构成了胚胎的组织与器官。卵白尿囊腔卵黄气室卵壳壳膜绒毛尿囊膜羊膜羊膜腔鸡胚胎9～11日龄鸡胚结构病毒学检验病毒学检验10病毒学检验病毒学检验11卵壳与壳膜卵壳位于最外层的坚硬壳层壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换气室功能主要是呼吸和调节压力绒毛尿囊膜壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官羊膜胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。病毒学检验病毒学检验12尿囊腔位于绒毛尿囊腔和羊膜之间，胚胎排泄器官；含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸盐卵黄囊主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养卵白外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养病毒学检验病毒学检验13病毒学检验病毒学检验14二、鸡胚的孵育和检查一、受精鸡卵的选择没有受到病毒和细菌的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌等；培养立克次体和衣原体，不能来自食用抗生素的鸡群。二、鸡胚的孵育孵育的温度38℃～39℃孵育的湿度40％～70％翻卵每天180°转动鸡胚1～2次通风排出CO2，吸入O2病毒学检验鸡卵发育中的胚胎发育中的胚胎破壳而出的小鸡卵白卵黄系带胚盘病毒学检验病毒学检验16病毒学检验病毒学检验17三、检卵目的了解鸡胚的存活情况，标记气室边界和胚胎位置；观察接种后胚胎的状况观察内容血管是否明显有无胎动绒毛尿囊膜发育之界线病毒学检验病毒学检验18病毒学检验病毒学检验19三、鸡胚的接种途径及方法一、实验材料与器械受精鸡卵孵卵箱检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器其它器材病毒学检验病毒学检验20二、接种途径与方法羊膜腔接种：主要用于临床材料（如患者咽漱液等）分离流感病毒。绒毛尿囊膜接种：常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离；病毒滴定、中和试验。尿囊腔接种：广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒的适应和传代。卵黄囊接种：主要用于虫媒病毒、衣原体、立克次体等分离和繁殖；抗流感病毒药物实验。病毒学检验病毒学检验211、羊膜腔接种分离流感病毒，收获羊水和尿囊液。羊膜腔接种示意图病毒学检验病毒学检验接种步骤与方法将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入O.1～0.2ml病毒液。拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持鸡胚钝端朝上。病毒学检验病毒学检验解剖与收获收获前鸡胚须置4℃冰箱6h或过夜，但不能放置时间过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置-20℃冰箱lh左右。预冷的目的是，将鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。病毒学检验病毒学检验242、绒毛尿囊膜接种牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，可在膜上可形成斑点状或痘疱状病灶。病毒滴定，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。抗体滴定，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。病毒学检验病毒学检验25定位将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出；在与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育较好的卵壳上划一直径约1cm的等边三角形卵窗接种步骤与方法病毒学检验病毒学检验26绒毛尿囊膜接种示意图取卵壳；造人工气室；接种；消毒；培养。病毒学检验病毒学检验用2.5％的碘酒和75％的酒精分别消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的胶布。用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用50％甘油保存。同时作无菌培养。27解剖与收获病毒学检验病毒学检验283.尿囊腔接种流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的传代。尿囊腔接种示意图病毒学检验病毒学检验291.照胚：取9~11日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。接种步骤与方法病毒学检验病毒学检验30标记气室和胚胎位置病毒学检验病毒学检验312.消毒气室向上放置鸡胚于卵架上；先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。3.打孔在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。距气室底边0.5cm病毒学检验病毒学检验32接种部位消毒病毒学检验病毒学检验334.注入病毒材料用1mL注射器抽取接种物；针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内；注入待接种的病毒液：接种量为0.1~0.2mL。病毒学检验病毒学检验345.封孔用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。6.孵育与观察气室朝上于37℃温箱中孵育；以后每天检卵1~2次。弃去24h内的死亡鸡胚：机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。病毒学检验病毒学检验35①收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血;②取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；③用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；④以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液6-10mL。⑤取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。解剖与收获病毒学检验病毒学检验36收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml病毒学检验病毒学检验374.卵黄囊接种用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖。卵黄囊接种示意图病毒学检验病毒学检验38四、病毒的检测（一）无菌试验目的：证实鸡胚收获物是否受到细菌的污染。方法：将鸡胚组织或收获的第一滴液体接种无菌肉汤；37℃培养36h。结果判定肉汤清亮透明，说明没有污染；肉汤混浊，或有菌落出现，说明鸡胚被细菌污染。病毒学检验病毒学检验39（二）检测方法直接观察法绒毛尿囊膜上形成损害或痘疱：如痘类病毒和疱疹病毒。引起鸡胚死亡：如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒。造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓，如马流感病毒。实验检测法血凝和血凝抑制试验：流感病毒补体结合试验：腮腺炎病毒其他：PCR等病毒学检验病毒学检验40病毒学检验病毒学检验第二节动物接种技术病毒学检验病毒学检验实验动物（experimentalanimals）是指经人工饲养，遗传背景明确、来源清楚，控制其携带的微生物，用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其它科学实验的所有动物。42病毒学检验病毒学检验43发现年份发现人所用动物血液循环1628哈维蛙、蛇、鱼、蟹、其他醚麻醉1846玛登鸟类、其他细菌与疾病的关系1878科赫牛、羊、其他细菌致弱用免疫1880巴斯德鸟类狂犬病免疫1885巴斯德鸟类、家兔虫媒传播疾病1898史密斯等牛蚊传播疟疾1898罗斯鸟类医学科学的重大发现与动物实验的关系病毒学检验病毒学检验44发现年份发现人所用动物肿瘤的病毒病原1910洛斯鸡胰岛素1921班定狗休克治疗1927博莱罗克狗抗细菌药物（百浪多息）1935多麦克小鼠心肺旁道器1953葛明猫小儿麻痹症疫苗1954索尔克恒河猴变性脑病的病毒病原1965格但斯克猩猩心脏移植1967伯纳德狗医学科学的重大发现与动物实验的关系病毒学检验病毒学检验45登革病毒对新生乳鼠的致病作用1-3日龄乳鼠接种病毒6日后，小鼠陆续出现体弱、弓背、行动迟缓等症状。病毒学检验病毒学检验46一、实验动物的种类和基本操作方法（一）实验动物的种类按微生物控制分类普通动物（CV）、清洁动物（CL）、无特定病原体动物（SPF）、无菌动物（GF）和悉生动物（GN）按遗传学控制分类近交系、封闭群、突变系、杂交群、转基因动物病毒学检验病毒学检验47按微生物学控制分类1、普通动物一级动物，指不携带主要人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的动物。实验结果不稳定；仅供教学示范及作为预备试验。病毒学检验病毒学检验482、清洁动物二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体。适用于大多数教学和科研实验。病毒学检验病毒学检验493、无特定病原体动物(SPF)三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的病原体外，还要求排除潜在感染或条件致病的病原体。目前国际公认的标准级别的实验动物。病毒学检验病毒学检验50饲养管理：SPF动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化的屏障系统中，实行严格的微生物控制。病毒学检验病毒学检验514、无菌动物和悉生动物四级动物。无菌动物要求现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何微生物和寄生虫。悉生动物又称已知菌动物，是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物，必须饲养于隔离系统。病毒学检验病毒学检验52无菌动物饲养条件：无菌隔离器。第一代通过无菌手术剖腹取胎,饲养在无菌隔离器内，人工喂乳或保姆代养培育而成。病毒学检验病毒学检验53悉生动物饲养条件：无菌隔离器。来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内带有已知菌，可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。病毒学检验病毒学检验54按遗传学控制分类1、近交系(inbredstrain)概念：又叫纯系，经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系。特点基因型相同，表现型一致；对外来刺激反应一致；实验结果重复性好，可比性强。病毒学检验病毒学检验55病毒学检验病毒学检验56常用近交系小鼠名称缩写品系名缩写品系名缩写AKRAKC57BL/10B10BALB/cCC57BRBRCBACBDBA/1D1C3HC3DBA/2D2C57LLHRS/JHRC57BL/6B6STSS病毒学检验病毒学检验57C3H/He系BALB/c系C57BL病毒学检验病毒学检验582、封闭群(closedcolony)概念：也称远交群，在不从其外部引入新个体的条件下，以非近亲交配方式至少连续繁殖4代以上生产的一个实验动物种群。特点群体遗传特异性相对稳定；个体间具有杂合性，存在一定差异。病毒学检验病毒学检验59常用