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课题一菊花的组织培养学习目标：掌握植物细胞的全能性，明确植物细胞体现全能性的条件。了解植物组织培养技术在生产中的应用。熟悉植物组织培养的基本过程。了解影响植物组织培养的各种因素。掌握植物组织培养的基本技术。有丝分裂受精卵细胞分化在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。1、细胞分化的概念一、知识回顾黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素；离体培养的上皮细胞，始终保持为上皮细胞，而不会变成其他类型的细胞。2、稳定性3、不可逆性细胞分化发生在整个生命进程中。1、持久性2、细胞分化的特点造血干细胞原红细胞早幼红细胞中幼红细胞晚幼红细胞成熟红细胞死亡4、普遍性细胞分化是否意味着细胞中遗传物质的改变？遗传物质没有改变，不同组织的细胞共同来源于受精卵，经有丝分裂产生。3、细胞分化的实质ABDCEEDCABEDCABEDCABEDCAB基因在个体发育过程中，不同细胞中遗传信息的执行情况不同即基因的选择性表达的过程红细胞合成血红蛋白(不合成肌动蛋白)肌细胞肌动蛋白基因开启合成肌动蛋白(不合成血红蛋白)肌动蛋白基因关闭血红蛋白基因关闭血红蛋白基因开启4、细胞分化的结果细胞产生了不同种类的蛋白质即出现了不同的结构和功能愈伤组织胚状体1958，美国，斯图尔德植物组织培养离体二、基础知识（一）植物组织培养概念关键词：外植体、脱分化、再分化、愈伤组织在无菌和人工控制条件下，将离体的植物（）培养在人工配置的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其脱分化产生愈伤组织再分化形成丛芽，最终形成。又称：植物离体培养器官、组织、细胞完整的植株由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。：用于离体培养的植物器官或组织片段。：细胞排列疏松、无规则、高度液泡化的无定形的薄壁细胞。外植体脱分化（或去分化）：再分化愈伤组织切取形成层无菌接种诱导愈伤组织的形成试管苗的形成培养室移栽脱分化再分化（二）植物组织培养的基本过程（三）植物组织培养的理论基础---细胞全能性概念：高度分化的植物细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。基础：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质。表达条件：离体条件无菌操作适宜物质的诱导和调节（植物激素）适宜的营养物质温度、酸碱度、光照等条件的控制思考这个试验说明了已经分化的细胞核具有什么特性？高度分化的动物体细胞的细胞核有发育成完整个体的潜能对比：多利羊的诞生动物细胞有没有这种能力？已经分化的细胞（核），仍然具有发育成完整个体的潜能。细胞全能性思考为什么已经分化的细胞具有全能性呢？高度分化的细胞含有保持物种发育所需要的全套基因植物组织培养技术动物的克隆技术1、培育无病毒植株2、大规模培养愈伤组织（提取紫草素，治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法（受体细胞为植物细胞）（四)植物组织培养的应用：3、人工种子（解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题）人工种子三、影响植物组织培养的因素1、材料的种类、年龄及保存时间长短等2、营养3、植物激素4、PH、温度、光照等条件1、植物材料的选择---直接关系实验的成败①不同植物的组织培养难度不同eg：烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝②同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。2、营养---MS培养基A、大量元素（）B、微量元素（）C、有机物：()D、植物激素：()赤霉素等Ｎ、Ｐ主要影响蛋白质、核酸的合成；K、Ca、Mg、S主要影响酶的活性。无机盐蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质；维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化；甘氨酸是蛋白质的组成成分，也是有机氮源。N、P、K、Ca、Mg、SB、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖生长素、细胞分裂素、萧县郝集中学MS固体培养基成分及比例讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。常用植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素、细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈加强的趋势激素的使用顺序、使用的量及比例影响植物细胞的发育方向3、植物激素的影响生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）等。赤霉素类：赤霉酸（GA3）等作用：2，4－D有利于愈伤组织的生长；IAA、NAA、IBA有利于器官分化。作用：促进细胞的分裂与分化，其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成。作用：促进不定芽和幼株伸长。使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂、也分化同时使用分化频率高使用比例实验结果生长素细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素细胞分裂素＝有利于根的分化有利于芽的分化，抑制根的分化促进愈伤组织生长激素的使用顺序、使用量及比例影响植物细胞的发育方向：植物组织培养过程离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养不需要光需要光需光否abABC补充下图（注：a、b过程，A、B、C为激素使用比例）a过程分裂方式（）b过程分裂方式（）有丝分裂有丝分裂思考：以下培养基出现的现象反应了什么问题？生长素/细胞分裂素高利于根的形成适中利于愈伤组织的形成供参考的配方1、诱导菊花愈伤组织：在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度均为0.5mg／Ｌ２、诱导菊花从芽：在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度分别为2---3mg／Ｌ和0.02—0.03mg／Ｌ3、诱导菊花生根：在MS培养基各成分用量减半，并添加入NAA或IAA，质量浓度均为0.1mg／Ｌ4．温度、光照、pH的影响光照：菊花每日用日光灯照射12h。温度：大多数植物组织培养控制在23～27℃，低于15℃时植物组织会表现生长停止；高于35℃时对植物生长不利。菊花的组织培养控制在18～22℃。pH：不同植物对培养基最适pH的要求不同，大多数控制在5～6.5。菊花的组织培养控制在5.8左右。制备MS固体培养基外植体消毒接种培养栽培四、实验操作移栽冲洗—酒精—无菌水冲洗—氯化汞—无菌水冲洗至少三次之上配制各种母液配制培养基灭菌（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4℃保存配制好的培养基母液来制备1、配制各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2、配制培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml①（）②（）③（）由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌配制培养液调PH培养基的分装在植物组织培养的过程中，为什么要进行一系列的消毒、灭菌，并且要求无菌操作？1、植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高：2、用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长,微生物产生的代谢废物会毒害培养的对象；培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃；因此要进行严格的无菌操作。1、选材：（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用吸干外植体表面的水分，放入中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液流水菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝体积分数为70％的酒精质量分数为0.1％的氯化汞溶液无菌吸水纸（三）接种1、接种前用体积分数70%酒精擦拭工作台，点燃酒精灯，所有操作在酒精灯旁边进行，每次使用器械后都要灼烧灭菌2、将装有培养基的锥形瓶整齐的排列在酒精灯左侧，将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（0.5-1cm）3、左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰。4、右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中，不要倒插，每瓶6-8块外植体，接种后，将封口膜重新扎好。5、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向：（）不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分形态学上端朝上，形态学下端朝下思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒培养温度控制在18-22℃每日用日光灯光照12h正常苗污染苗1、外植体带菌2、培养基及接种器具灭菌不彻底3、接种操作时带入4、环境不清洁污染途径（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。一般放置在20～25℃的遮荫环境中，适应5～7d。试管苗不萎蔫，有新生长的趋势，便可移栽。1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间3、移栽幼苗长壮后，移栽到土壤中固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培珍珠岩,珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩，经急剧冷却而成的玻璃质岩石，有弧形或圆形裂隙，如珍珠的结构，所以被命名为珍珠岩。蛭石是一种天然、无毒的矿物质，在高温作用下会膨胀的矿物。它是一种比较少见的矿物，属于硅酸盐。（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。小组讨论：在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？结果分析与评价（一）对接种操作中污染情况的分析（二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化（三）是否进行了统计、对照与记录（四）生根苗的移栽是否合格五、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季营养繁殖扦插嫁接压条扦插嫁接压条探究植物激素的使用比例（A=生长素/细胞分裂素）对植物组织培养的影响例如：设计对照实验（1）不加植物激素（2）A＝1（3）A＞1（4）A＜1菊花的组织培养再分化材料性质、营养物质、调节物质、环境条件外植体的消毒接种基本原理:细胞的全能性基本过程:脱分化愈伤组织影响因素：操作流程：配制MS固体培养基培养移栽栽培练习1.答：植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，对培养条件的要求较高。用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。而培养物一旦