发酵产物的提取与精制

第四篇发酵产物的提取与精制第九章发酵产物的提取与精制概论第一节发酵产物的提取与精制概述一、发酵产物的分类1、菌体2、酶3、代谢产物二、下游加工过程的特点1、成分复杂：细胞、代谢产物、残余培养基2、产品浓度低：传统发酵一般1～10％3、收率低：50％左右4、失活问题5、不稳定性6、生物安全问题三、下游加工过程设计应遵循的基本原则1、时间短2、温度低3、pH适中4、清洁卫生四、发酵产物提取与精制的过程1、对未知的发酵产品提取的步骤（1）确定发酵产物的类型（2）确定发酵产物的稳定性2、发酵产物提取和精制过程包括的阶段（1）发酵液的预处理离心和过滤（2）产品的提取萃取、吸附、沉淀、蒸发（3）产品的精制层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳（4）产品的最后加工结晶、干燥、蒸馏第二节发酵醪的预处理一、发酵醪的一般特征1、含水量高，一般可达90％～99%2、产品浓度低3、悬浮物颗粒小，密度与液体相差不大4、固体粒子可压缩性大5、液体黏度大，大多为非牛顿型流体6、产物性质不稳定二、发酵醪预处理的目的和要求1、预处理的目的：（1）改变发酵液的物理性质，促进悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中（多数是液体）（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。2、发酵醪预处理的要求:（1）菌体的分离（2）固体悬浮物的去除（3）蛋白质的去除（4）重金属离子的去除（5）色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除（6）改变发酵醪的性质（7）调节适宜pH值和温度三、预处理的方法：1、加热法：降低悬浮液的黏度，除去某些杂蛋白，降低悬浮物的最终体积，破坏凝胶状结构、增加滤饼的空隙度不适用热敏性的物质2、调节悬浮液的pH通过调节发酵醪pH到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀，同时络合重金属离子；常用的酸化剂有草酸、盐酸、硫酸和磷酸3、凝聚和絮凝凝聚：在投加的化学物质（比如水解的凝聚剂，像铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚成1mm大小块状凝聚体的过程。凝聚剂的作用：有些是对初始粒子表面电荷的简单中和，另一些是消除双电荷层（采用中性盐例如NaCl等）而脱稳，还有些是通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚絮凝：使用絮凝剂（通常是天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚剂和絮凝剂的种类：（1）凝聚剂：主要是无机类电解质，大多为阳粒子无机盐类：硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、三氯化铁、氯化铝、硫酸锌、硫酸镁、铝酸钠金属氧化物类：氢氧化铝、氢氧化铁、氢氧化钙、石灰聚合无机盐类：聚合铝、聚合铁（2）絮凝剂（按官能团分）阴离子、阳离子、非离子丙烯酰胺经不同的改性可成为上述三种类型之一絮凝剂比凝聚剂贵絮凝剂的最佳使用剂量：粒子表面积约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量。4、添加助滤剂：一般为惰性助滤剂：是一种颗粒均匀、质地坚硬、不可压缩的粒状物质作用：助滤剂表面具有吸附胶体的能力，并且由此助滤剂颗粒形成的滤饼具有格子型结构，不可压缩，滤孔不会被全部堵塞，可以保持良好的渗透性使用方法（1）：在滤布上预涂，作为过滤介质使用（2）：按一定比例混入待滤的悬浮液中常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的碳、炉渣、重质碳酸钙5、添加反应剂：添加可溶解的盐类，生成不溶解的沉淀；生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构；沉淀本身可作为助滤剂，还能使胶状物和悬浮物凝固。6、添加酶制剂：比如：加酶将多糖转化为单糖四、菌体的分离方法（1）离心分离管式高速离心机、碟片式离心机（2）过滤真空过滤机、板框过滤机、五、细胞破碎细胞破碎的意义微生物代谢产物大多数分泌到胞外，但有些目标产物存在细胞内部。目前重组DNA技术，表达的产品（如胰岛素、干扰素、白细胞介素等），都是胞内产物。首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。常用破碎方法机械法：珠磨法、高压匀浆法、超声波破碎法、X-press法等非机械法：酶溶法、化学渗透法、冻融法、干燥法等1、机械破碎法特点：处理量大、破碎效率高、速度快；原理：对物料的挤压和剪切作用；主要方法：高压匀浆珠磨超声波破碎高压匀浆（1）原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的间隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急速释放到低压环境，在撞击力与剪切力的综合作用下破碎。（2）影响破碎率的因素：细胞壁、压力、温度、通过匀浆器的次数不适合丝状真菌及包含体的基因工程菌珠磨工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极小的研磨剂，即微球（玻璃小珠、石英砂、氧化铝d1mm）一起快速搅拌，细胞与微球之间互相碰撞、剪切，使细胞破碎，释放内含物。特点：微球粒径与目标细胞的直径比应在30-100之间，适宜的微球粒径，可以使破碎效率最高；破碎过程产生热能，要注意热交换；适用于绝大多数微生物细胞的破碎；珠磨法的破碎率一般控制在80%。超声波破碎1、工作原理在超声波的作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎2、影响因素：声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型3、特点：1）适应于实验室规模的应用（操作简单、液量损失少，可加冰或加冷水，大规模操作时，声能传递和散热困难）2）易失活物质不宜用（超声波可促使产生一些化学自由基因使物失活）3）G-杆菌破碎效果好，酵母菌效果差2、非机械法（1）酶溶法：（2）化学法利用化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法①酸碱来调节溶液的pH②有机溶剂：甲苯③表面活性剂：都是两性化合物，分子中有一个亲水基团和一个疏水基团，在适当的pH值和离子强度下，他们聚集在一起形成微胶束，使膜的通透性改变或使之溶解（3）物理法①渗透压冲击法：将细胞放在高渗透压的介质中，达到平衡后，转入到低渗透压的缓冲液或纯水中②冻融法：低温冷冻而在室温下缓慢融化③干燥法：热空气干燥、真空干燥、冷冻干燥