(03)金属螯和层析

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1金属螯和层析操作规程一、溶液配制1、8×Binding溶液40mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.92、4×Elute溶液4M咪唑2MNaCl80mMTris-HClPh7.93、8×Wash溶液160mM咪唑4MNaCl160mMTris-HClpH7.95、4×strip溶液40mMEDTA2MNaCl80mMTris-HClPh7.9注:(1)如样品在变性状态下,则应在Binding,Elute,Wash溶液中加入4~8M的尿素。(2)PH的调节应在加完尿素和稀释完储液后调节。二、层析过程21、装柱将适当体积的柱料装入层析柱,用超纯水以工作流速的压实柱料(至少三个柱体积),以获得均一的柱床,同时避免带入气泡。注:以下的层析操作流速不要超过装柱流速的1.75倍。2、柱平衡由层析系统依次五个柱体积的Charge溶液和三个柱体积的Binging溶液。注:柱子挂上镍离子后,可在Binging溶液中过夜,4℃。3、上样视样品的多少可选用LOOP或由泵直接上样两种方式,接穿透峰以备SDS-PAGE检测。4、淋洗十个柱体积的BINDING溶液洗过后,用六个柱体积的WASH溶液淋洗,以去除非特异结合的蛋白质,接穿透峰以备SDS-PAGE检测。5、洗脱对于未知的蛋白初提液,可采用10mM~500mM的梯度洗脱,并使用SDS-PAGE检测活性峰。6、柱再生用六个柱体积的STRIP溶液洗去镍离子。7、柱保存用水,20%的乙醇依次过柱,置于4℃保存。注意:(1)层析具体操作中各缓冲溶液的注入量以PH及电导基线基本不再变化为止。(2)所有的样品和溶液层析前,应脱气和过膜(0.45μm)。(3)当柱流速明显减低或层析介质被charge后不再变蓝时,需再生柱子。再生的方法:依次将以下的溶液按建议的体积数处理介质。两个柱体积的8M的尿素,两个柱体积的水,一个柱体积的2%SDS,一个柱体积25%的乙醇,一个柱体积50%的乙醇,一个柱体积75%乙醇,一个柱体积3100%乙醇,一个柱体积75%乙醇,一个柱体积50%乙醇,一个柱体积25%乙醇,一个柱体积水,五个柱体积100mM的EDTA(PH=8.0),三个柱体积水,三个柱体积20%的乙醇,储存于4℃。(4)加变性剂的Binding溶液应在平衡的最后步骤中使用,故应配两组Binding溶液,即8×且不含尿素和1×含尿素。(5)DTT,BME,EDTA应避免在层析溶液中,因为DTT,BME会与镍离子形成棕色沉淀,而EDTA会剥离镍离子。(6)为减少样品的粘度,可用Dnase处理(不用超声时),方法如下:在样品液中加入终浓度为10mMMgSO4,20μg/mlDnase室温放置20分。但此种处理方法会增加样品被蛋白酶水解的危险。(7)加入蛋白酶抑制0.2M的乙醇溶液,-20℃储藏。工作浓度为储液稀释200倍。(PMSF在水溶液中的半衰期短)。(8)Wash溶液的咪唑需调节,与组氨酸的长度有关。如六个组氨酸所需的淋洗浓度低于十个组氨酸所需的淋洗浓度。(9)变性蛋白质的一般复性方法。A、透析既逐步降低变性剂的浓度;B、稀释法(10)可将变性剂直接加入到Binding,Washing,Elute溶液中,但需在加入变性剂后调节PH至所需的值。

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