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1植物组织培养（下）专题一、胚乳培养及应用主要内容一、引言二、胚乳培养的历史三、胚乳愈伤组织的建立（重点）四、胚乳愈伤组织再生植株的途径五、胚乳再生植株的染色体倍性变异六、胚乳培养的应用七、存在问题及研究热点一、引言(一)胚乳简介裸子植物胚乳：受精前形成，单倍体（雌配子体）类型被子植物胚乳：双受精的产物，天然的三倍体组织。没有胚乳的种子：绝大多数双子叶植物的种子。豆科和葫芦科的种子，单子叶的慈姑和泽泻种子胚在发育过程中可把胚乳完全消耗掉（大豆、花生、蚕豆）。有胚乳的种子：禾谷类、双子叶的椰子、蓖麻、咖啡、烟草、番茄、辣椒和柿等植物的种子。胚乳在成熟种子中依旧存在，并在其中贮存了大量的营养物质。在种子萌发期间，这些物质被消化并用于幼苗的早期生长。(二)胚乳的优点胚乳是理想的实验材料和试验系统。1.从胚乳培养获得再生植株，就有可能建立起三倍体新类型，或是藉以产生无籽果实，或是利用其营养体生长优势。2.对实验形态发生学，胚乳组织是一种极好的材料。原因：它是一种均质的薄壁细胞组织，完全没有维管成分的分化。3.胚乳是研究一些天然产物的生物合成和代谢的理想系统。原因：自然条件下，胚乳细胞内储存着大量淀粉、蛋白质和脂类，以供胚发育和种子萌发之需。二、胚乳培养的历史（4个事件）1933年，Lampe和Mills就进行了胚乳培养的最初尝试。1949年，LaRue首次报道了由玉米未成熟胚乳建立起能够不断生长的愈伤组织，但未分化器官。1965年，Johri和Bhojwani在一种檀香科寄生植物柏形外果中，发现由培养的成熟胚乳直接分化出了三倍体茎芽，从而有力推动了胚乳培养研究的继续发展。1973年，印度学者Srivastava首次由自养被子植物罗氏核实木的成熟胚乳培养中，获得了三倍体胚乳再生植株，并进行了移栽，只是成活与否未见报道。已在48种植物中进行过胚乳培养研究；获得器官分化程度不等的愈伤组织但未再生完整植物的物种有25种；再生完整植物的物种有11种12例。三、胚乳愈伤组织的建立2(一)胚乳愈伤组织形成的过程胚乳→培养基上→培养(时间各异)→体积增大→胚乳的表面细胞(如水稻)/内层细胞(如苹果)分裂形成原始细胞团→肉眼可见的愈伤组织。(二)胚乳愈伤组织的类型（颜色、质地）白色致密型：多数植物白色松散型：少数植物枸杞淡黄色松散型：少数植物枸杞绿色致密型：猕猴桃(三)影响胚乳愈伤组织形成的因素（重点）1.基因型供体植株的基因型是胚乳培养的关键因素，不同基因型植株的胚乳对培养基的反应不同，愈伤组织诱导率、分化率、胚状体诱导率及植株诱导率都不同。结论：想通过胚乳培养获得理想的三倍体植株，必须对同一种植物的不同品种（基因型）进行大量实验。2.胚乳的发育时期旺盛生长期→取材的最适合时期旺盛生长期的胚乳特点：胚已分化完成，胚乳已形成细胞组织，且已充分生长，几乎达到成熟时的大小，外观为半透明的固体状，富有弹性。3.胚因子①处在旺盛生长期的未成熟胚乳，在诱导培养基上无须原位胚的参与。②完全成熟的胚乳，特别是干种子中的胚乳，在诱导其脱分化形成愈伤组织之前，必须首先借助于原位胚的萌发使其活化。③接种时胚乳的生理状态介于旺盛生长期和成熟期之间：没有原位胚参与时能形成愈伤组织，有原位胚参与时则能显著提高愈伤组织的诱导率。4.培养基成分⑴基本培养基植物胚乳培养所采用的基本培养基为MS、MT、B5和White。⑵植物激素单子叶植物的胚乳培养→在培养基中补充一定浓度的2，4-D/也可用NAA和IAA→能有效地诱导愈伤组织。双子叶胚乳的培养→培养基中添加一定浓度的细胞分裂素并配以适量的生长素→能有效地诱导愈伤组织的形成。⑶碳源研究表明：在胚乳培养中蔗糖、葡萄糖、果糖效果最好；乳糖、阿拉伯糖、半乳糖和棉子糖有抑制作用；淀粉能维持胚乳的生长。⑷附加成分研究表明：水解酪蛋白(CH)、酵母提取物(YE)、番茄汁、葡萄汁、青玉米汁及抗氧化物质(如聚乙烯吡咯烷酮等)等外源添加物的添加能促进胚乳培养。5.培养条件(温度、光照、pH)温度：低温(4～7℃)处理可使胚乳形成愈伤组织的频率有所提高。愈伤组织生长的最适温度为25℃。光照：因物种而异。玉米胚乳——暗培养；蓖麻胚乳——1500lx的连续光照；其他物种的胚乳培养——多数为10～12h/d光照。3pH：要求较高，不同植物适宜pH不同。一般是在4.6-6.3之间；玉米胚乳愈伤组织在pH7.0时生长最好。四、胚乳愈伤组织再生植株途径(一)器官发生途径直接和间接器官发生两种方式：直接器官发生：胚乳→芽→根→完整植株。培养基中的激动素（KT）和CTK浓度较高或不含有生长素，胚乳可直接产生芽。例：在自养被子植物胚乳培养研究中，麻疯树直接分化出三倍体芽。间接器官分化：胚乳→愈伤组织→芽→根→完整植株。若培养基上含有一定浓度的生长素（单子叶植物）或一定浓度的细胞分裂素并配以适量的生长素（双子叶植物）会诱导胚乳产生愈伤组织，愈伤组织在适宜浓度的生长素和细胞分裂素的培养基上能分化出芽。例：Nakano等最早报道了水稻未成熟胚乳愈伤组织在含有IAA的培养基上分化出茎芽。大麦、小黑麦杂种和玉米等的未成熟胚乳愈伤组织在配合使用细胞分裂素和生长素的培养基上都分化了茎芽。在获得了胚乳再生植株之后，大部分植物需要诱导再生植株生根。两种生根方式：（1）诱导的芽在仅含较低浓度生长素的生根培养基上进行培养；（2）诱导的芽经过较高浓度的生长素短时间处理后置于没有植物生长调节剂的培养基上。另外：降低生根培养基中无机离子的浓度和蔗糖浓度，往往有利于胚乳苗生根和以后的移栽。具体做法：当苗长到2～5cm高时，切除其基部的愈伤组织，将苗基部先用较高浓度(50～100mg/L)的IBA溶液浸泡一定时间后再插入无激素培养基中，经过2～3周，即可长出不定根。(二)胚状体发生途径胚乳→愈伤组织→胚状体→根→完整植株研究表明：培养基中激素水平和无机盐浓度对胚状体的发育和成苗有促进作用。在胚乳培养中，一般情况下，2，4-D对胚状体的发生有明显的诱导作用，但对胚状体的发育和萌发又有抑制作用。而6-BA、GA3对胚状体的发育和成苗往往具有重要作用。和器官发生相比，在胚乳培养中通过胚状体发生途径获得再生植株的报道较少，迄今成功的植物有柑橘、柚、檀香、橙、桃、枣、核桃和猕猴桃等。附：背景知识在植物有性生殖中，精子和卵结合形成合子，合子进一步发育成胚。双受精（doublefertilization）是指被子植物的雄配子体形成的两个精子，一个与卵融合形成二倍体的合子，另一个与中央细胞的极核（通常两个）融合形成初生胚乳核的现象。双受精后由合子发育成胚，初生胚乳核发育成胚乳。合子经过短期的休眠后进行不均等分裂，产生一个较大的基细胞(basalcell)和一个较小的顶端细胞(apicalcell)。基细胞在珠孔端，由它分裂形成胚柄(suspensor)，顶端细胞在合点端，经若干次分裂后形成原胚，再依次经过球形期、心形期、鱼雷形期和成熟期最终成为成熟胚。小孢子：异形孢子囊植物产生的两种孢子中较小的孢子。可发育为雄性配子体。在种子植物中，相当于在单核期发育的花粉粒。在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。4我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。五、胚乳再生植株的染色体倍性变异仅少数植物的胚乳愈伤组织及再生植株的倍性较为稳定。例：罗氏核实木、檀香、核桃、橙和柚等。在胚乳培养中，胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常常发生变化。倍性混乱较为普遍。造成胚乳细胞在培养中染色体数不稳定性的原因可能有：①①胚乳的类型。如果胚乳组织本身就是一个多种倍性细胞的嵌合体（核型胚乳），由它产生的愈伤组织和再生植株也不可能是稳定一致的三倍体。②不同部位的胚乳细胞染色体组成情况可能有所不同。③培养基中外源激素的种类和水平影响。④继代培养时间的长短。六、胚乳培养的应用1.胚乳培养作为通过三倍体而获得产生无籽果实的一种手段。2.三倍体可以提高植物产量与改良品种。3.三倍体植株加倍可产生同源六倍体。同源六倍体在植物育种上具有重要的价值。4.胚乳培养可以用来研究淀粉、蛋白质和脂类等的生物合成与调控七、存在问题及研究热点存在问题1.植物胚乳植株的诱导率总体上较低，不能形成足够的选择群体。2.植物胚乳培养对基因型的依赖性较强，性状优良的品种/无性系很难诱导出三倍体植株。研究热点以下几方面进行深入研究：1.依据对胚乳植株利用目的的不同，选择具有代表性的优良品种、品系进行胚乳培养，综合运用各种手段提高胚乳植株的诱导率。2.在提高胚乳植株诱导率的基础上，将胚乳培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，在短时间内，培育高抗优质的胚乳植株新品种。3.在提高胚乳植株诱导率的基础上，构建三倍体群体，为分子标记、遗传图谱的构建、基因克隆以及各种遗传学研究提供理想的研究材料。专题二、花药与花粉培养AntherandPollenCulture主要内容一、引言二、花药与花粉培养的历史三、花药与花粉培养的特点（重点）四、花药培养（重点）五、花粉培养六、花粉/药植株形态发生方式七、花粉植株的倍性八、花粉植株的染色体加倍一、引言花药培养包括单倍体的花粉细胞培养和二倍体的药隔、药壁、花丝等细胞培养。因此由5花药培养形成的完整植株就包括二倍体植株单倍体植株。花粉培养仅包括单倍体花粉细胞的培养，因此花粉培养获得的是单倍体植株。花药培养和花粉培养从严格的组织培养的角度上讲，二者是不同的。很多文献没有将花药和花粉培养严格区别开；而是在花药和花粉培养中，突出了花粉发育为单倍体植株的过程。二、花药与花粉培养的历史总体情况自1964年经花药培养获得首例单倍体以来，各国单倍体研究竟相开展，进展神速，大致经历了以下三个阶段。实验研究阶段：二十世纪60年代初至70年代未；作物品种育种应用阶段：二十世纪80年代初至90年代单倍体尤为双单倍体(DH)与分子生物学有机结合应用阶段：二十世纪90年代初以后花药培养的历史1964年开始，20世纪60年代末至70年代初，花药培养研究进入迅速发展期。花粉培养的历史1950年开始（裸子植物）；1964年，被子植物花粉离体培养的成功为高等植物遗传育种开辟了新途径。我国花药培养始于1972年。目前，我国在花药培养和单倍体育种工作方面，处于国际先进行列！我国学者公认的研究贡献（理论）：朱至清等1975年和1990年建立了被国内外广泛使用的N6和改良N6培养基；孙敬三等(1979)发现由于花粉质体DNA降解引起的质体RNA和蛋白质匮乏是白化苗形成的原因；欧阳俊闻等（1983）确立了单核中期的小麦花粉最适于产生花粉植株，以及较高的温度有利于花粉绿苗的形成；卫志明（1986）首次指出0.3mol/L甘露醇处理小麦游离小孢子5d，可大幅度提高花粉胚的产率。三、花药与花粉培养的特点（重点）1.取材方便，起始状态容易一致化。(1)花粉分散密集于花药囊中，培养时取材方便；(2)花粉大小、形状、内含物成分等基本一致，是比较均一的材料;(3)便于在不同条件培养时的相互比较和同一条件下的同步培养。2.获得纯合系的时间缩短。(1)由花粉离体培养为单倍体植株；(2)以秋水仙素进行人工染色体加倍，迅速获得纯合的2倍体植株。3.无显性掩盖隐性基因的现象。(1)单倍体植株的单套染色体，使表现型和基因型完全一致；(2)在育种中可避免“误选”，从而大大提高工作效率。四、花药培养（antherculture）定义：是指把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。培养类型：器官培养（一）花药培养的优缺点优点：取材方便6缺点：①因培养基的营养物质须先经几层药壁细胞的代谢与转化才能提供给花粉细胞；给花粉的脱分化研究增加了复杂因素。②后代倍性较乱(2n、n等)，给单倍体植株的筛选带来难度。③花药中花粉的数目庞大，培养量不易人为掌握。（二）花药培养的过程（5步）1.取材（外植体的选择）选材时注意以下几方面：①品种（基因型