(参考)2012-住院医师讲课-朱晓丽.

免疫组化染色技术及其应用复旦大学附属肿瘤医院病理科朱晓丽病理诊断方法光镜HE电镜免疫组化分子病理免疫组化的优点高度特异性敏感性高方法步骤统一形态、机能和代谢密切结合免疫组化原理用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测抗体的基本结构Fc四条多肽链，呈Y型轻链两条——Fab,结合抗原重链两条——Fc，结合二抗重链决定抗体的类型IgA,IgD,IgE,IgG,IgMCOOH多克隆抗体（PolyclonalAntibodies）抗原（antigen)→羊，马，鼠，兔，鸡↓B淋巴细胞产生IgG↓动物血清纯化↓特异性IgG（约1–10mg/ml）抗体类型抗体类型鼠单克隆抗体（MouseMonoclonalAntibodies）抗体类型兔单克隆抗体（RabbitMonoclonalAntibodies）常用方法___直接标记法适用于：高亲和力抗体高密度抗原(10Kmolecules/cell)常用方法___间接标记法适用于：敏感性更高低密度抗原(2K,10Kmolecules/cell)LAB法（标记生物素－抗生物素技术）ABC法（抗生物素－生物素－过氧化物酶复合技术）聚合物-共轭技术（EnVision，DAKO）EnVision两步法原理EnVision两步法步骤将4～5μm的石蜡组织切片进行常规脱蜡脱水置0.01MpH6.0柠檬酸中，100℃修复抗原10分钟，保温10分钟滴加一抗（根据产品说明书做相应稀释）50~100μl于切片上，切片放置在湿盒内，4℃冰箱过夜反应TBS洗涤3次，2分钟/次滴加二抗于切片上，37℃反应1小时TBS洗涤3次，2分钟/次DAB显色15～45分钟待组织呈棕色时终止显色，水洗干净苏木复染脱水、透明、封片免疫组化各环节的注意点(1)固定目的：保持细胞形态和组织结构完整性，不损害细胞内有效成分和抗原活性10%中性福尔马林90％的抗原都能在10%中性福尔马林（固定时间约24小时）中室温保存冰冻切片4ºC冷丙酮室温10分钟切片和涂片玻片处理防脱片白胶（Elmer’sGlue)，多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin)和防脱片剂（APES)切片厚度4～5μm，平整无皱折或刀痕涂片均匀，细胞不重叠脱蜡务必彻底内源性酶的阻断免疫组化各环节的注意点(2)抗原修复重要环节抗原修复方法物理方法热修复——微波，水浴，高压化学方法蛋白酶消化——胰蛋白酶最常用抗原修复液95ºC0.1M柠檬酸缓冲液PH6.00.5M或1.0MEDTA缓冲液PH8.0抗原修复时注意:切片质量很重要温度和时间掌握不当会发生非特异性反应热抗原修复后应注意自然冷却热处理过程中修复液切勿煮干有些抗原不一定需要进行抗原的修复免疫组化各环节的注意点(3)第一抗体最关键环节一抗稀释度（浓缩型抗体）根据抗体说明书的稀释范围找出最佳稀释度一抗孵育时间、温度4℃冰箱过夜37℃温箱/常温2小时抗体的正确保存－20℃或4℃冰箱保存免疫组化各环节的注意点(4)第二抗体1）一抗种属来源主要根据一抗种属来源来决定确定二抗的类型，如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可（如羊抗小鼠、兔抗小鼠等均可）2）一抗类型二抗需与一抗的类别或亚类相匹配,通常针对单克隆抗体而言一抗二抗多克隆抗体(IgG类免疫球蛋白)抗IgG抗体单克隆小鼠IgM抗小鼠IgM单克隆小鼠IgG的某一亚类所有抗小鼠IgG或相应抗（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3）小鼠IgG亚类染色剂•DAB-H2O2显色棕黄色•AEC显色紫红色•镜下观察染色强度，定位，水中中止染色•苏木素衬染免疫组化各环节的注意点(5)免疫组化各环节的注意点(6)设立对照•阳性对照排除假阴性•阴性对照排除假阳性•自身对照免疫组化各环节的注意点(7)免疫组化结果的判断阳性判断•阳性定位细胞核细胞浆细胞膜•阳性分布局灶型片块型弥漫型网状型腺管型腔缘型菊团型免疫组化结果的判断(1)阴性免疫组化结果的判断(2)ER细胞核免疫组化结果的判断(3)GAL-3细胞浆HER2/neu细胞膜免疫组化结果的判断(4)免疫组化结果的判断•免疫组化分数染色强度×阳性细胞数染色强度弱阳性1+中度阳性2+强阳性3+阳性细胞数弱阳性25％中度阳性25～49％强阳性≥50～80％报告中的结果：细胞核％；细胞浆、细胞膜1+~3+免疫组化各环节的注意点(8)免疫组化结果的判断原则必须设对照抗原表达必须在特定部位阴性结果不能视为抗原不表达IHC与HE切片诊断应以HE切片诊断为准免疫组化常见问题分析(1)石蜡切片脱片现象1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；2）用防脱片的切片；3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。边缘效应1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致.解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。免疫组化常见问题分析(2)非特异性背景着色1)抗体孵育时间过长、抗体浓度高2)一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色3)内源性过氧化酶未完全阻断4)正常动物血清使用不合理5)DAB孵育时间过长或浓度过高6)PBS冲洗不够免疫组化常见问题分析(3)假阳性结果1)抗体稀释度不正确,浓度太高2)抗体的交叉反应3)组织中抗体的非特异性结合4)内源性酶的着色5)组织中抗原的弥散6)“异位”抗原的表达免疫组化常见问题分析(4)假阴性结果1)抗原修复方法欠佳2)抗体失活或浓度不当3)抗原丢失或减弱4)血清封闭时间过长5)DAB孵育时间过短6)固定和温度62ºC7)操作步骤失误8)切片干燥免疫组化常见问题分析(5)免疫组化双染原理：根据阳性表达部位和阳性表达区域不同所建立的一种直观的多色定位的染色方法。其标记的对象是两种或两种以上的细胞部位。主要标记部位如下：1.膜+浆型2.膜+核型3.浆+核型注意：最好不要膜+膜，核+核，以免影响效果和颜色重叠。免疫组化双染注意事项：1.玻片的处理：双重免疫组化步骤繁多，两次热修复对玻片涂胶要求较高，以免脱片。2.两种显色系统的顺序：颜色可能产生重叠，所以应该先让不容易显的放在前面，容易出色的放在后面。无特别说明，还是先出HRP系统，后AEC系统。3.双染两个一抗不能来源于同一种属。4.双重染色要有目的性，不可盲目双重染色造成结果无说服意义免疫组化双染的应用用于区分常规HE染色下较难辨别的部位例如：脉管系统中淋巴管道和血管管腔无法肉眼区分。恶性肿瘤的扩散显示例如：恶性肿瘤细胞的浸润在正常黏膜下呈慢性吞噬，如果对上皮和肿瘤细胞同时标记，可以更直接的观察渗透情况。不同细胞在同一区域的分布情况组织有限免疫组化双染步骤免疫组化双染抗体DAKOCocktail:AMACR-CKHMW-CK5/6(兔单抗，Clone13H4;鼠单抗，Clone34BE12;鼠单抗，CloneD5/16B4)第二部分免疫组化的自动化免疫组化操作的自动化BenchMark–XT（ROCHE公司）染色模块独立条码标签，30张切片/循环液体模块7瓶，90张切片废液处理模块液面感应监测废液液面ROCHE自动免疫组化仪优点独立切片条码标签自动识别，包含患者相关信息空气涡漩混匀技术充分混匀试剂，保证染色均一性LiquidCoverlip液体封盖膜技术防止液体蒸发，有效保证组织完整性ThermoFlexPad独立温控技术每张切片精确控温Bond-Max(LEICA公司)免疫组化诊断的自动化AriolSL-50电脑、服务器50片高通量自动送片储片器（带条形码阅读器）全自动荧光正置显微镜高速CCDAriolSL-50使用范围•免疫组化分析(其中乳癌Her-2/neu、ER、PR表达分析通过FDA认证）•组织芯片分析和虚拟芯片构建•细胞和组织FISH分析(其中Her-2/neu基因扩增分析通过FDA认证）•免疫荧光分析•微血管密度分析•DNA倍性分析•骨髓及前哨淋巴结稀有细胞查找(骨髓中稀有细胞查找通过FDA认证）•网络远程会诊Ariol系统在临床诊断中的应用三个功能模块通过美国FDA认证免疫组化分析(乳癌Her-2/neu、ER、PR表达分析）细胞和组织FISH分析(Her-2/neu基因扩增分析）骨髓中稀有细胞查找结果判断的问题人的主观差异性人眼疲劳引起的差异性Ariol应用于IHC分析在5x，10x，20x或40x放大倍率下快速自动扫描能够区分核染，质染和膜染区域选择连续切片中H&E染色片子上的感兴趣区域后，可使用SlideLink功能自动关联选择其它连续切片上的相关区域对染色进行分析时既可以用数字精确定量也可以使用传统的0，+1，+2，+3方法来进行计数可使用客户自定义的域值屏蔽掉非特异性背景的染色可使用客户自定义的形态学参数定义的分类器屏蔽掉非感兴趣细胞AriolIHC训练(Training)细胞核细胞膜细胞核细胞膜细胞核着色：ERPRKi67每个区域分别评分每个区域分别计数细胞最终评分为所选多个区域的平均值所有区域的平均值，结果更客观准确诊断报告：图文并茂，客观准确HE与IHC区域关联Ariol分析IHC的优点人工分析主观差异精度不高只能定性与半定量分析重复性欠佳Ariol系统分析•结果客观•提供标准化数据•精确的量化•重复性好乳腺癌中ER/PR、Her-2、Ki67检测的意义ER、PR指导内分泌治疗的选择，预后判断Her-2指导靶向药物、化疗药物的选择，预后判断Ki67预后判断Ariol图像分析的重要价值定量分析乳腺癌中Her-2/neu、ER、PR、Ki67蛋白的表达客观准确的结果，更有利于病人的治疗及预后判断免疫组化在病理诊断中的应用及价值肿瘤组织产生多种多样的异质性抗原，是识别各种肿瘤的标记物，包括：•组织特异性抗原(tissuespecificantigen)TTF-1PSA•肿瘤性胚胎性抗原(oncofetalorfetalantigen)CEAAFP•细胞谱系抗原(celllineageantigen)VIMDESNSE•细胞机能表型标记物(phenotypicmarkersofcellfunction)LC表面抗原•异位抗原（heterotopicantigen)内分泌肿瘤合成的异位激素免疫组化在病理诊断中的应用及价值提高病理诊断准确性肿瘤来源的判断上皮和非上皮肿瘤的鉴别诊断•上皮源性CK•间叶源性Vim•淋巴瘤LCA•恶性黑色素瘤HMB45转移性癌的原发灶来源的确定同一肿瘤的转移灶与原发灶具有共同的抗原性表达免疫组化在病理诊断中的应用及价值指导肿瘤治疗•明确诊断对治疗具有重要意义•对靶向治疗的指导乳腺癌内分泌治疗ERPRHerceptin靶向治疗Her-2/Neu胃肠道间质瘤CD117弥漫大B细胞淋巴瘤CD20免疫组化在病理诊断中的应用及价值发现微小转移灶CK对肿瘤增生程度的评价Ki67PCNA对预后的判断p53nm23第二部分与肿瘤靶向治疗相关的标记ER,PR(ASCO/CAPGuideline)HER-2(ASCO/CAPGuideline)EGFRc-kitVEGFCD20JClinOncol28:15s,2010(suppl;abstr2537)第二部分与肿瘤靶向治疗相关的标记Targetedcancertherapies:FDAapprovaloverviewASCO/CAPGuidelineRecommendations(2010