(第七章)第八章植物花药(花粉)培养.

第八章植物花药（花粉）培养与单倍体育种第八章植物花药（花粉）培养与单倍体育种第一节有关基本概念及含义第二节花药和小孢子的发育第三节花粉培养第四节花药培养第五节花药（花粉）培养中白化苗产生的机理及影响因素第六节花药（花粉）培养及单倍体育种的应用第一节有关基本概念及含义1、植物花药与花粉（粒）花药是植物花的雄性器官，由两部分细胞组成：（1）体细胞——药壁和药隔组织的细胞，按染色体倍性，为二倍体细胞。（2）雄性性细胞，即小孢子，又称“花粉粒”——花粉粒的细胞，为单倍体细胞。2、花药培养（Autherculture）:指把植物花药在合成培养基上进行培养，诱导花粉（粒）再生植株的方法。属于一种器官（植物雄性器官）培养。第一节有关基本概念及含义3、花粉（粒）培养（Pollenculture）:指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。属于单细胞培养。4、白化苗指在花药（花粉）培养中，禾本科特别是水稻因受有关因素影响，出现缺绿白化的再生植株称之。第一节有关基本概念及含义5、单倍体育种指通过花药（花粉）培养诱导单倍体花粉植株，经加倍纯合，快迅、准确地选育出植物新品种的一种育种方法。将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体。直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原始材料，称之为单倍体育种。第二节花药和小孢子的发育1．花药分化与花粉粒形成花药是储存花粉粒的器官，1个花药里可有成千上万个花粉粒。花药的分化程序如图1所示：在高等植物有性繁殖的世代交替生活史中，花粉代表雄配子体世代，它通过小孢子形成过程产生。第二节花药和小孢子的发育2、母体内小孢子的正常发育高等植物的小孢子母细胞发育至成熟的花粉粒，整个发育程序大致可分为三个时期：第一期是小孢子母细胞通过减数分裂形成四分体；第二期为四分体分离开来，单个小孢子继续发育；第三期是小孢子发育为成熟的花粉粒。（图2）第二节花药和小孢子的发育（以烟草花粉发育过程为例，说明被子植物花粉发育过程，P222）第一期：小孢子母细胞经减数分裂形成孢子四分体，随胼胝质分解，4个小孢子分离。第二期：小孢子为球形细胞，核大，有液泡，挤核靠边（单核靠边期），期末细胞明显增大，细胞壁特化，小孢子进行第一次花粉细胞有丝分裂（不对称），形成2个不均等的细胞。第三期：小孢子细胞中有2个核。在离体培养条件下，花粉发育偏离正常发育途径，第一次花粉细胞有丝分裂是对称的，结果形成两个形态和体积相等的细胞，把此作为B型。第二节花药和小孢子的发育3、离体培养的小孢子的发育途径在离体培养的条件下，由于改变了小孢子原来的生活环境，花粉的正常发育途径受到抑制，出现不同的小孢子发育途径。对大多数植物来说，离体培养条件下，诱导小孢子雄核发育的最适时期是处于单核中、晚期的花粉（花药）。（在四分体或双核期虽也有成功报导，与后讲选材时期有关）。第二节花药和小孢子的发育离体培养条件下，小孢子雄核发育主要有如下几条途径：（图—3）（1）营养细胞发育途径（A途径）：即小孢子第一次有丝分裂，形成一个营养核和一个生殖核，其生殖核较小，一般不分裂或分裂几次便逐渐退化而败育，而较大的营养核不断分裂形成细胞团，并迅速增殖成单倍性的愈伤组织或胚状体，最后形成单倍体植株（图—3A）。（2）生殖细胞发育途径（B途径）在此途径中，营养核分裂1～2次即退化了，而生殖核经多次分裂发育成多细胞团，进而通过形成单倍性的愈伤组织或胚状体而产生单倍体植株。（图—3B）第二节花药和小孢子的发育（3）营养细胞与生殖细胞并进的发育途径（C途径）：即小孢子中形成的生殖核和营养核同时分别持续分裂，最后形成由营养核分裂而成的细胞较大的多细胞团和由生殖核分裂而成的细胞较小的多细胞团所共同构成的单倍性愈伤组织或胚状体（图—3C），最后也可产生单倍体植株。（4）小孢子均等分裂途径（D途径）小孢子第一次分裂时为非正常的有丝分裂，即进行均等分裂形成二个均等的子核，以后二核间产生细胞壁而形成两个大小一致的子细胞，分别分裂而成多细胞团，进而发育成单倍性的愈伤组织或胚状体而产生单倍体植物（图—3D），此种途径较普遍。第二节花药和小孢子的发育（5）小孢子内均等核融合途径（E途径）：即小孢子第一次异常有丝分裂产生的两个均等的子核间不形成细胞壁，因而它们可相互融合，使核二倍化，最后形成纯合二倍性的愈伤组织或胚状体（图—3E）。上述离体培养的小孢子发育的几种方式是最常见的。在某一具体植物的花药或花粉培养中，可能出现一种或两种以上的不同发育方式。第三节花粉培养花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。1、花粉培养的优点：（主要有4点）（1）花粉（多采用单核中、晚期）本身已是单倍体细胞，因此，诱导它经愈伤组织或胚状体发育成的小植株均为单倍体植株，不会因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成体细胞植株。（2）能直接从单细胞开始观察整个雄核发育进程。（3）由于花粉是真正的单细胞单倍体，因此，其群体能匀质地接受各种化学和（或）物理的因子处理，是诱导突变和转化的有用材料。（4）花粉能直接发育成胚，对研究雄核发育的生理生化等问题提供了方便。第三节花粉培养缺点：是技术难度大，迄今除茄科的一些植物种外，许多重要作物的花粉培养至今未获成功，尤其是在禾本科中只有水稻由游离花粉培养获得绿色再生植株。但随着科学的发展，技术和设备的改进，将会取得不断成功和应用。第三节花粉培养2、花粉培养技术花粉培养技术由花粉分离和花粉培养两个基本程序组成。（1）花粉分离花粉分离方法有自然散落法和机械挤压法两种。①自然散落法（P227）即先接种花药，当花药自动裂开时，花粉散落在培养基上，移走花药。如用液培，1～2天后，花粉散落后用200目滤网过滤，再接种培养。②机械挤压法（P227）在有液体培养基的玻璃瓶内，用玻棒轻轻挤压花药，使花粉逸出，再用200目过滤网除去药壁等体细胞组织，得到花粉进行接种培养。第三节花粉培养（2）花粉培养花粉培养方法主要有以下5种：①平板培养法：谷明光等（1977），即，琼脂包理法将等量的花粉悬浮液与温度达45℃左右的含1.2%琼脂的液状培养基混合，混匀后倒入培养皿中制成平板进行培养。水稻花粉经培养38～48天后形成愈伤组织，烟草花粉培养两个月后形成球形胚。②看护培养法（P228）Sharp等（1972）用此法培养番茄花粉获得单倍体愈伤组织。第三节花粉培养③微室悬滴培养法（P229）用含若干花粉粒的液体培养基作成悬滴。④条件培养法：在合成培养基中加入失活的花药提取物，再接入花粉进行培养。⑤预培养法在多数花粉培养成功的实例都是来自经花药预培养后的花粉。第四节花药培养第四节花药培养鉴于花粉培养技术难度较大，目前由游离花粉培养获得单倍体植株的成功例子太少，而通过花药培养获得单倍体植株者却相当普遍，因为花药培养同样可以获得和游离花粉培养那样所得到的单倍体花粉植株，而且手续大大简化，不需要进行游离花粉的处理程序，也不需要特殊的培养装置，所以花药培养是应用最为广泛的一种方法。第四节花药培养花药培养技术主要包括以下几个环节：1、材料选择：2、材料预处理：3、材料灭菌：4、花药接种：5、脱分化培养：6、再分化培养：7、花粉植株移栽：8、染色体加倍：第四节花药培养1、材料选择：从几个方面考虑：（1）材料基因型：不同种的植物，对花药（粉）培养的诱导反应极为不同。实验证明，供体植株的遗传背景对花药培养成败关系甚大。例如：水稻中，粳稻比籼稻容易培养，花粉愈伤组织诱导率，前者一般平均可达10％，后者只有1～2%。不同品种间也有差异，对水稻而言，花药培养力（愈伤组织诱导率和绿苗分化率）的大小顺序为：糯型＞（粳×籼）杂种＞粳型＞籼型杂交稻＞籼型。（李梅芳，1991）。小麦、烟草不同品种也有高有低。第四节花药培养（2）材料生理状态花药供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率有直接影响。对水稻、小麦和大麦等禾本科植物而言，大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率都明显的要高。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化，例如：水稻，早造比晚造接种的愈伤组织诱导率要高；烟草，开花早期比开花晚期的花药可产生更多的花粉植株；小麦，早期接种比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2～3倍。说明供体植株的生态环境，特别是温度和光周期可能对花粉发育及其对离体培养的反应有重要影响。第四节花药培养（3）花粉发育时期接种花药的花粉发育时期，是决定花药培养能否成功的关键因素。花药培养研究中早已发现，只有培养花粉发育到一定时期的花药，对外来刺激才最敏感，且易诱导产生愈伤组织或胚状体。不同植物的花粉对外来刺激的敏感时期是不同的。例如：水稻、烟草的花粉，从单核中期到双核期均可接受诱导，而小麦、玉米等花粉则以单核中期为佳，番茄、大麦则还要更早些。木本植物如柑桔、杨树、苹果、三叶橡胶及枸杞等均以接种单核期花药为宜。总的来看，大多数植物在单核期特别是单核中后期比较敏感。因此，可以此时期的花药作为主要接种材料。第四节花药培养如何选择确定花粉发育时期，可从两个方面：一是从植株有关器官的外部形态来选择。因为花粉发育时期与植株有关器官的外部形态有直接联系。如水稻在剑叶与下一叶的叶枕距5～8厘米、花药为颖壳长的1/2，淡黄色，此时花粉母细胞基本为单核靠边期：烟草此时的花蕾的花冠大约与萼片等长，等等。据此可在田间初选材料，即把符合要求的穗子或花蕾取回。二是进行镜检确定对从田间选取的材料用“醋酸洋红压片法”进行镜检，以确定花粉的发育时期。第四节花药培养2、材料预处理对所取用的穗子或花蕾，进行低温、激素（生长素）或其他方法预处理，能有效提高愈伤组织诱导率和苗分化率。（1）低温预处理：一般是将材料置于冰箱5～10℃下冷藏一定时间再接种。处理时间视不同植物而定，水稻在5～10℃时为5～8天，烟草在7～9℃时为7～14天。同种植物不同品种的要求也有差异，需作试验比较才能确定。第四节花药培养（2）激素（生长素）预处理对母体植株或取回的穗子、花蕾预先用一定浓度的2.4—D、NAA等生长素喷洒，到一定时间后再取其花药接种。这对提高愈伤组织诱导和苗分化的频率也有一定效果。（3）糖的预处理：高糖浓度→适宜糖浓度。对提高一些植物的花药培养效果明显。第四节花药培养3、材料灭菌：取回的材料，在接种前必须进行表面灭菌。一般方法是先用70～75%酒精擦洗穗子和花蕾的外部苞叶，然后用0.1%升汞浸泡7～10分钟（水稻、玉米等需剥取穗子浸入消毒液）或用饱和漂白粉溶液浸泡10～20分钟以灭菌，最后用无菌水冲洗3～5次，供接种用。材料灭菌是花药培养成功与否的一个重要环节，此关不过，谈不上什么培养。第四节花药培养4、花药接种：在无菌条件下（超净工作台上），把花药从小穗或花蕾中取出，接入固体或液体培养基。接种方法因不同植物而异。如水稻，可用“剪颖抖药法”，即先将小穗在颖壳2/3处剪下（内含花药），然后用镊子夹取带花药的颖壳，剪口朝下在试管口或三角瓶口敲打，使花药抖落在培养基表面。又如玉米，可用“去颖夹药法”，即用手捏住小穗颖壳上部，持镊子将花药基部的颖壳夹去掉，挤出花药敲接入培养基表面。一般每管或每瓶接种花药30～50个。第四节花药培养5、脱分化培养：脱分化培养主要是为诱导花药（花粉）产生愈伤组织。诱导培养基视不同植物需要可采用不同基本培养基和激素配比。如水稻，一般用N6作基本培养基，附加2.4—D2～3mg/l+KT1～2mg/l+水解乳蛋白（LH）500mg/l+蔗糖（S）30g/l+琼脂（Ag）4g/l，pH=5.8。花药接入诱导培养基后，一般置于黑暗条件，25～28℃下培养以诱导愈伤组织。用不同基本培养基和激素配比。第四节花药培养6、再分化培养：再分化培养主要是使花药（花粉