(第九章)第十章体细胞无性系变异及突变体筛选

第十章体细胞无性系变异及突变体筛选授课老师：韦鹏霄第十章体细胞无性系变异及突变体筛选第一节体细胞无性系变异第二节植物细胞突变体的筛选第一节体细胞无性系变异一、体细胞无性系变异的定义二、体细胞无性系变异的普遍性三、体细胞无性变异的表现及类型四、体细胞无性系变异的频率五、体细胞无性系变异的机理六、体细胞无性系变异的特点七、影响体细胞无性系变异的因素八、体细胞无性系变异在育种上的应用九、体细胞无性系变异的几个实例第一节体细胞无性系变异一、体细胞无性系变异的定义体细胞无性系变异（Somaclonalvariation）（我们在第一章第二节“植物细胞工程常用术语”中曾叙述到）——指在组织培养过程中，来自体细胞的培养物及再生植株发生的变异。此句里面还有2层意思：第一层意思是这一变异来自组织培养，以区别于一般所指的自然变异、遗传变异和理化诱变；第二层意思是这一变异发生在体细胞，而不是性细胞，以区别于花药（花粉）培养。这一定义最早来自Larkin（拉金）和Swwcroftl（斯考史罗夫特）（1981），以后，Evanz（埃文斯）（1984）、Larkin（1985）和朱自清（1991）等对此作过评述。1990年又出版了Bajai（巴扎）主编的有关体细胞无性系变异的专著。体细胞无性系变异有遗传性的和生理性的，遗传性的变异主要为基因和染色体发生的变异，可代代遗传；生理性的变异主要是由于环境条件的改变，使组织或细胞的某些生理功能发生变化，一般不能遗传。（在多种植物出现同种变异，在同种植物出现多种变异）第一节体细胞无性系变异二、体细胞无性系变异的普遍性大量资料表明，体细胞无性系变异是植物组织培养过程中出现的普遍现象。已经观察到体细胞无性系变异的农作物有：甘蔗（Heinz,etal,1971）、马铃薯（Oono,1987）、小麦（Larkin,etal,1984）玉米（Peschke,etal,1987）燕麦（Cummingsetal,1976）大麦（Deambrogio,1980）,小黑麦（Nakamura,etal，1982）、谷子（赵连元等，私人通信）、油菜（Hoffmann,etal.,1982）、大豆（Freytag,etal.,1981）、兰花（魏亚鉥，1992）、蕃茄、茄子、瓜类，甜菜、菊苣、烟草、草莓、桃、天竺葵、倒挂金钟、香石竹、水晶掌和锦带花等（Bajaj,1990）。1971年，Heinz（海因茨）和Mee（米）报道甘蔗再生植株中存在广泛的变异，包括形态学、细胞遗传学和同工酶谱。其中观赏植物的无性系变异可利用性很广泛，是值得注意的新动向。组织培养中的这种体细胞无性系变异既不限于某种物种，也不局限于某些器官。变异所涉及的性状也相当广泛。第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型体细胞无性系变异主要表现在以下几个方面：（或分为几种类型）1、植株外部形态的变异2、育性上的变异3、生长势上的变异4、抗性变异5、某些酶或同工酶发生差异6、次生代谢物的差异7、染色体结构或数量上的变异8、某些基因组DNA的变异第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型1、植株外部形态的变异（1）株高：高于或矮于原供体植株，如水稻、小麦，烟草等；（2）叶形：1）大于或小于原供体植株；2）形状不同于原供体植株，如烟草；（3）叶色：1）有叶片条纹，如燕麦；2）叶片缺绿（白化苗），如玉米（4）茎色：茎有条纹，如甘蔗，茎有黄色条纹（呈黄绿相间），像一种竹（斑竹）。（5）穗型：1）大于或小于原供体植株；2）密于或疏于原供体植株。（6）粒型：1）大于或小于原供体植株；2）大于或短于原供体植株。（7）粒色：不同于原供体植株。（8）芒性：1）芒有无；2）芒长短。第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型2、育性上的变异变异表现为全不育或半不育，如水稻、番茄等。3、生长势上的变异（1）抽穗期：早于或迟于原供体植株，如水稻，玉米。（2）花期：早于或迟于原供体植株（3）成熟期：早于或迟于原供体植株（4）杂种优势：生长势强于原供体植株，如玉米。第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型4、抗性变异（1）抗病性：强于原供体植株。①抗玉米小斑病毒；②抗甘蔗斐济病毒，霜病毒；③抗水稻白叶枯病；④抗马铃薯晚疫病、枯萎病。（2）抗代谢物：（3）抗铝毒性：如水稻（国际水稻研究所，Swwcroft,1986）（4）耐盐性：比原供体植株耐盐。第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型5、某些酶或同工酶发生差异（1）α—淀粉酶，如小麦（2）酯酶同工酶，如甘蔗6、次生代谢物的差异第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型7、染色体结构或数量上的变异（1）染色体结构：1）染色体桥：如胡萝卜、单冠毛菊、烟草等2）染色体X、2X、3X、4X、8X……3）落后染色体：如柳杉（2）染色体数量：1）非整倍体：如柳杉、常春藤、龙葵、小麦等；2）多倍体：如五针松、西藏长叶松、烟草、大麦等；3）混倍体：如玉米、茄子等。第一节体细胞无性系变异三、体细胞无性变异的表现及类型8、某些基因组DNA的变异（1）核基因突变：①单基因突变（隐性或显性）；②多基因突变。（2）细胞质基因突变：①线粒体基因变异；②细胞质雄性不育基因突变，不育→可育第一节体细胞无性系变异四、体细胞无性系变异的频率体细胞无性系变异的频率在一些作物上是非常高的，可达10%以上。表14-4：一些植物的体细胞无性系变异（表型）出现的频率植物种再生植株来源表型变异频度（%）研究者菠萝幼果愈伤组织100Wakasa(1979)裔芽愈伤组织98Wakasa(1979)腋芽愈伤组织34Wakasa(1979)冠芽愈伤组织7Wakasa(1979)烟草体细胞愈伤组织10Popchristov和Zaganska(1977)水稻胚愈伤组织71.9Oono(1978)幼穗愈伤组织97.3赵成章等（1982）甘蔗幼叶愈伤组织18Heinz(1971,1976)马铃薯幼叶愈伤组织100Shepard(1980)玉米体细胞愈伤组织14Green(1977)表14-4：一些植物的体细胞无性系变异（表型）出现的频率第一节体细胞无性系变异五、体细胞无性系变异的机理对体细胞无性变异现象，由于是在上世纪七十年代末期才开始系统研究，所以迄今对其起因尚未完全清楚。总的来说不外乎两方面的原因：一是供体组织的细胞中原已发生变异，当它们再生成完整植株时，这种变异便表现出来。但对这种看法目前尚无足够的实验证据。二是组织培养循环过程诱导培养的细胞产生变异，这点已为许多试验所证实。第一节体细胞无性系变异六、体细胞无性系变异的特点主要有4点：1、变异广泛：2、后代稳定性：3、能基本保持原品种特性4、潜在隐性性状活化第一节体细胞无性系变异六、体细胞无性系变异的特点1、变异广泛：如前所述，植物体细胞无性系变异现象相当普遍，变异所涉及到的性状也相当广泛，包括数量性状和质量性状的变化，染色体数目和结构的变化、DNA扩增或减少，生化特性的变化等。2、后代稳定性：虽然体细胞无性系再生植物的绝大部分性状变异是生理效应，不能遗传，但也有少数性状变异是可以遗传的，如水稻的粒型、丛生型、抗病性等。这些可遗传的变异通常在再生植株二代便可稳定下来，成为稳定株系。但也有部分株系是杂合体继续产生分离。不过这种分离多属简单分离，分离的程度与供体植株的遗传背景有关，一般小麦稳定株系为30~50%，水稻为90%左右。第一节体细胞无性系变异六、体细胞无性系变异的特点3、能基本保持原品种特性因为体细胞无性系变异大部为单一性状变异，做能基本保持原品种的特性。4、潜在隐性性状活化在体细胞无性系后代中，常见一些原供体植株所没有的隐性性状变异，象雄性不育性、矮杆、叶绿体突变等，有些隐性特性对育种实践具有重大利用价值。由于体细胞无性系变异具有上述4个特点，因此，在育种上的应用日益受到重视。第一节体细胞无性系变异七、影响体细胞无性系变异的因素影响体细胞无性系变异频率的因素很多，主要有：1、植物的繁殖类型：2、外植体的来源部位：3、植物再生的方式：4、继代培养次数和培养时间：5、生长调节剂浓度的影响：第一节体细胞无性系变异七、影响体细胞无性系变异的因素1、植物的繁殖类型：一般认为长期营养繁殖的植物变异率较高，有人认为这是由于外植体的体细胞中已积累着遗传差异。自然条件下，如一些果树的芽变（在无性繁殖、扦插、嫁接等）。2、外植体的来源部位：不同来源部位的外植体，无性系变异频率有较大的差异。如菠萝，来源于顶芽组织（冠芽）的较低，而其它来源的较高。3、植物再生的方式：通过愈伤组织分化不定芽的方式再生的植株变异多，通过胚状体途径再生的植株变异较少。通过茎尖或分生组织培养增殖侧芽，可以保持基因型基本不变。第一节体细胞无性系变异七、影响体细胞无性系变异的因素4、继代培养次数和培养时间：随着愈伤组织继代培养次数和培养时间的增加，变异率不断增高，（实为激素累积影响，“激素累积效应”）年龄幼小的培养物再生的植株变异率低，年龄偏老的培养物再生的植物变异率较高。5、生长调节剂浓度的影响：在高浓度生长调节剂作用下，细胞分裂和生长均加快，但不正常分裂频率增高，再生植株的变异也增多。第一节体细胞无性系变异八、体细胞无性系变异在育种上的应用体细胞无性系变异在育种上应用的时间虽然不长（从1971年开始系统研究甘蔗无性系算起，这方面工作仅有20多年历史），但一些育种学家已利用它有效地进行品种改良，并已育出一些新品种。如台湾从甘蔗再生植株中选育高糖量的品种；中国水稻研究所（赵成章）从水稻无性系中选出高产新品种；美国的DNA植物技术研究所从番茄无性系中选出了新品种；Shepard等和Matern等也分别从马铃薯原生质体细胞系中选育出了一些新的高产或抗病新类型，等等。第一节体细胞无性系变异八、体细胞无性系变异在育种上的应用利用体细胞无性系变异育种有如下主要优点：（6点）１、变异率较高；（前已讲，高于自发变异和理化诱变）如水稻，经组培获得的突变率可达16.7%，经理、化处理的诱变率一般为7~8%，比高2倍。2、致死和半致死突变率低于常规诱发突变；用常规物理诱变，如CO60照射，致死和半致死突变率较高3、单基因变异频率高；利用此种变异可改变作物的个别性状而不使其它优良性状发生重组及分离。4、可在试管中筛选特定的变异体；5、如采用单倍体细胞作为培养物，隐性变异可在当代（Ro）表现，利于选择；6、育种周期较短。第一节体细胞无性系变异八、体细胞无性系变异在育种上的应用体细胞无性系变异用于育种的主要程序（2种）待改良的品种组织或细胞培养物变异R0R1群体选择（决选）改良了的无性系性状稳定性评价田间试验多点试验区域试验品系新品种测定变异的遗传基础回交图：孢子体体细胞[二倍体]无性系变异选育品种程序再次组织培养待改良的品种单倍体花粉愈伤组织单倍体植株纯合二倍体植株（H1）人工加倍变异花药（粉）培养H2选择变异株H3选择变异株或株系H4测定变异的遗传基础品系多点试验回交稳定性评价区域试验品种二倍体愈伤组织杂合二倍体植株（H1）变异变异前自然加倍二倍体愈伤组织变异后自然加倍图：配子体（花粉）细胞无性系变异选育品种程序第一节体细胞无性系变异九、体细胞无性系变异的几个实例（一）水稻：1、Oono（1981）种胚→愈伤组织→再生植株→变异后代2、赵成章等（1982），幼穗→再生植株→高产、抗病（白叶枯病）（二）麦类：1、Larkin和Scowcroft(1984),未成熟胚→再生植株（三）玉米：（四）其它作物：1、甘蔗：2、烟草：3、五针松：第二节植物细胞突变体的筛选一、细胞突变体的有关概念二、植物细胞突变体筛选的发展由来三、利用培养的细胞诱变与筛选突变体的优缺点四、离体培养细胞突变的判断标