(第五章)第六章植物离体茎尖培养与培育.

第六章植物离体茎尖培养与培育无病毒苗第一节培育植物无病毒苗的意义第二节防治病毒的方法第三节茎尖培养脱毒第四节脱毒实例第一节培育植物无病毒苗的意义我们知道，多数栽培植物，尤其是无性繁殖的植物，都易受到一种或几种病毒的侵染。例如，已知草莓能感染62种病毒和类菌质体；侵染马铃薯的病毒也多达30多种左右。随着栽培时间的推移，各种植物中侵染病毒的种类越来越多，如核果类1930年报道只有5种病毒，1950年已达到了48种，而1976年则达到95种。第一节培育植物无病毒苗的意义近年来病毒的侵染范围有日益扩大的趋势，故危害日趋严重。据报道，植物病毒已超过500种，严重危害着农业生产。受病毒侵染的农作物生长迟缓、畸形，产量大幅度下降、品质变劣，甚至完全丧失商品价值。第一节培育植物无病毒苗的意义1975~1976年，仅广东汕头地区，就因黄龙病而死掉的柑桔树达60万株。柑桔的衰退病曾经毁灭了巴西的大部分柑桔，圣保罗州600万株甜橙死亡（占总数75%），至今仍威胁着世界柑桔产业。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10%~50%。枣疯病毁灭掉我国北京密云的金丝小枣。苹果绣果病也是我国果树生产上亟待解决的病毒病。第一节培育植物无病毒苗的意义1960年以来，日本草莓因病毒病的危害，产量严重降低，品质大大退化，使草莓生产受到灭顶之灾。马铃薯病毒病（主要有十几种病毒）的危害更是全球普遍性的问题，已引起人们的高度重视。第一节培育植物无病毒苗的意义目前，对细菌和真菌侵染植物后所引起的病害，可以通过药物处理达到治愈的目的，但是现在还没有什么药物处理可以治愈被病毒侵染的植物。因此，培育植物无病毒苗，在生产上具有重要的现实意义和应用价值。培育植物无病毒苗，关键是防治病毒的侵染。第二节防治病毒的方法防治病毒主要有物理方法、化学方法和生物学方法，其中以生物学方法更为有效。简介如下：1、物理方法：即通过X射线、紫外线、超短波和高温处理等，以钝化植物病毒。其中以热处理最为常用。热处理又称温热疗法（thermotherapy）。其基本原理是植物处在较高于正常温度的环境中，组织内许多病毒能部分地或全部地被钝化，而对寄主组织很少或不会伤害。第一节培育植物无病毒菌的意义ABC低温生长区域温热疗法区域无伤害病原体被清除寄主植株被杀死图示：植物生长的温度区域与温热疗法区域相对关系图解B-C是热处理的临界区域；寄主（C）和寄主病原体的热死点之间的宽广范围，为温热疗法提供较宽的温度。高温第二节防治病毒的方法热处理可由热水或热空气提供。热水处理适用于休眠器官（如种子、块茎、休眠枝条和芽等）；热空气处理对活跃生长的器官有较好效果，而且使用较方便。方法：将活跃生长的植株移置温热治疗室（或箱）内，曝于35~40℃中一般适宜时间便可。第二节防治病毒的方法处理温度和时间因植物种类和器官生理条件等不同而异。短则几十分钟，长则达数月。在热处理初期，空气温度必须逐步升高，直至达到所要求的温度为止。被处理的植株必须含有充足的有机养分。同时，处理室内要维持合适的相对湿度和光照。考虑到连续长期在为病毒钝化所需要的高温中，对寄主组织会带来危害，因此，也有采用高、低温交替处理方法。第二节防治病毒的方法温热治疗的主要缺陷是并非所有病毒对温度都是敏感的。例如，在马铃薯中，只有卷叶病毒能用此法根治。Quak(1977)认为，热处理对防治等径的病毒CisometricViruse和类似线状的病毒（thread-likeviruse）以及为支原体所导致的疾病才有效，对杆状和线状的病毒作用不大。而且对寄主植物所作的长时间热处理会钝化植物组织内的阻抗因子，从而增加无效植株的发生率。经热处理后，往往只有少数植株能存活下来。第二节防治病毒的方法2、化学方法：即用能抑制病毒复制的一些化学物质如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤等和某些病毒抑制剂，如蛋白质与核酸合成抑制剂，以抑制植物病毒。但因这些化学物质或抑制剂同时对寄主组织也有害。故在生产上不常用。第二节防治病毒的方法3、生物学方法：即通过种子繁殖、愈伤组织和茎尖分生组织培养等方法脱除植物病毒。种子繁殖对有性繁殖植物合用，但对植物无性繁殖没用。愈伤组织培养虽可脱除病毒，但易引起变异，故不常用。茎尖分生组织培养是目前最有效的治疗病毒病的方法，几乎对所有病原体，包括所有病毒均有效，而且该法周期短、效率高，又能与快速繁殖相结合。该法与温热疗法配合使用，效果更佳。第三节茎尖培养脱毒(一)茎尖培养脱毒原理(二)茎尖培养脱毒方法的建立、发展和应用(三)茎尖培养脱毒一般过程(四)茎尖培养脱毒基本技术第三节茎尖培养脱毒（一）茎尖培养脱毒原理众所周知，病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织（茎尖）一般来说是无病毒的，或者只带有浓度很低的病毒，可能的原因是：（4点）第三节茎尖培养脱毒1、在植物体中，病毒的移动主要有两条途径，其一是维管系统，而在顶端分生组织不存在维管系统；其二是胞间连丝，但这条途径的移动速度很慢，难以追赶上活跃的茎尖。因此，在顶端分生组织（茎尖）中，病毒的移动受阻。2、在旺盛的顶端分生组织（茎尖）中，代谢活性很高，使病毒无法进行复印。3、在茎尖中存在高水平内源激素（生长素），可以抑制病毒的增殖。4、在植物体中可能存在一种“病毒钝化系统”（virusinactivatingsystem），它在顶端分生组织（茎尖）中的活动应最高，因而茎尖组织不受侵染。第三节茎尖培养脱毒（二）茎尖培养脱毒方法的建立、发展和应用最早，由Holmes(1948)通过茎尖扦插的方法，由受侵染的大丽花中获得了无病毒植株。Morel和Martin（1952）根据这一原理，建立了消除病毒的茎尖培养方法。此后，茎尖培养方法得到迅速发展，现已成为最有效的获得无毒植株的方法，已成功用于多种栽培作物。利用茎尖培养不仅可以消除病毒，还可以消除植物体中多种其它病原菌。目前该技术已在农业生产上得到广泛的应用。据不完全统计，用茎尖培养方法已成功对60多种植物的100多种病毒进行“脱毒”。第三节茎尖培养脱毒马铃薯茎尖培养培育脱毒植株是最成功的例子。我国种植马铃薯面积达330万公顷，占世界第二位，由于病毒感染导致品种退化，严重减产。“北种南调”。中科院与内蒙古、黑龙江、甘肃等20多个省、市、自治区60余个单位协作，用茎尖培养快速育苗和病毒鉴定，以解决马铃薯的病毒感染问题。至1985年，我国培育的马铃薯无病毒品种已超过100个，许多已在生产上大面积应用。”第三节茎尖培养脱毒（三）茎尖培养脱毒一般过程这一过程大体可分为以下四个阶段：1、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类。2、脱毒：根据所携带的病毒种类选择合适的处理方法。3、鉴定：对再生植株进行鉴定，从中选出无病毒苗。4、繁殖：选择合理的繁殖方法和防止病毒再侵染的措施，对繁殖的植株进行检测。第三节茎尖培养脱毒（四）茎尖培养脱毒技术不同植物在技术细节上是不同的，但原则上有共同点：1、材料的选择。因为植物脱毒的目的是为了提高农作物、果树、蔬菜的产量和质量，恢复其高产优质的种性，因此在材料选择时应注意以下几点：第一，品种要可靠；第二，对农作物、果蔬要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作为脱毒材料；第三，名贵稀有的植物良种。只有这样，脱毒材料才能收到较大的经济效益。第三节茎尖培养脱毒2、将经消毒处理过的芽、茹类的嫩茎在双筒解剖镜下，仔细地剥去生长锥外围的幼叶和叶原基，直至露出圆滑的生长锥。由于不同植物其生长锥的形状、大小、外围幼叶与叶原基的着生方式均有不同，因而剥取方法也有所不同。剥取茎尖时最重要的是迅速准确，因为剥取茎尖是在解剖镜下进行，如速度太慢就很容易污染；方法不准确则容易损伤生长锥，这样就达不到培养目的。第三节茎尖培养脱毒3、接种。茎尖剥取完毕后，用锋利的解剖刀，小心切取所需大小的生长锥，一般为0.2～0.5mm，带有1～2个叶原基，并随即接种于适宜的培养基上（参书P8-12，表8-2）进行培养，每瓶接种1个茎尖。4、培养。培养基成分及培养条件基本与离体茎培养相似。但由于茎尖比较小，故培养基中的无机盐浓度可以适当降低；但适当提高K+的浓度有利于芽的分化。第三节茎尖培养脱毒在正常情况下，接种一周茎尖的颜色逐渐变为绿色，基部逐渐增大，有时形成少量愈伤组织，茎尖开始伸长。大约1个月左右，即可看到明显伸长的小茎，形成可见的小叶，这时可转到继代培养基（有时继代培养基与初代培养基相同）中继续培养，获得大量丛生芽，将2cm以上长度的幼嫩无根苗转到生根培养基上可诱导生根，形成完整植株。第三节茎尖培养脱毒在材料接种前可结合进行“温热处理”：对母株，在35～38℃中热处理5～10周；对马铃薯，将块茎在37～38℃中处理1个月。第三节茎尖培养脱毒(五)脱病毒植株的检定常用的检测方法有5种：1、植株直观测定法：2、指示植物测定法3、电子显微镜观测法4、血清学方法5、分子生物学检测法第三节茎尖培养脱毒1、植株直观测定法：即直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状特征。这是一种最简单的方法。缺点是寄主植物出现症状，需时较长，不能很快取得检定结果；有的病毒病并不使寄主表现可见症状，无法用此法检测。第三节茎尖培养脱毒2、指示植物测定法：即从待测植株上取下叶子，置研钵中加等量（W/V）0.1mol﹒L-1磷酸盐缓冲液研磨成匀浆。然后，在指示植物的叶上轻抹上一种磨料粉末与待测植株的叶片浆液，如果接种的汁液含有病毒，约经数天或几周后，指示植物便会呈现特有的症状。以此来测定（待测）培养所得的植株有无病毒。比较重要的指示植株有：藜属的Chenopodiumamaranticolor(苋色藜),Chenopodiumquinoa(昆落阿藜)，千日红（Gomphrenaglobosa）和各种烟草等。本法的缺点是对于不能在较短时间内使指示植物呈现症状的潜伏性病毒难以检定。第三节茎尖培养脱毒3、电子显微镜观测法：即直接用电子显微镜观察待测植株的叶片中有无病毒颗粒。具体操作方法可参阅有关专著。本法是一种既准确又科学的方法。缺点是实践中不易应用，因耗价高，只有很少数实验室具有电镜设备，并需要训练有素的专门技术人员操作。第三节茎尖培养脱毒4、血清学方法该法灵敏度高，获得检测结果迅速，是目前快速检测任何病毒的一种最好的方法。抗原——引起形成抗体的物质（病毒或异体蛋白）。抗原和抗体结合，表现为很强的特异性。即由一种病毒产生的抗体，只能结合该种病毒。抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内。这种含有特异性“抗体”的血清称为“抗血清”。抗原和抗体相结合的反应称为“血清反应”。为了诊断准确，往往需要多种检测法配合进行。第三节茎尖培养脱毒病毒感染人工注射异体蛋白动物动物蛋白血清反应带该种病毒＋免疫球蛋白(抗体)(抗原)(抗原)图血清鉴定法示意图第三节茎尖培养脱毒5、分子生物学检测法（1）核酸分析核酸分析包括直接对病毒及类病毒基因组核酸电泳分析和根据已知的基因组核酸系列设计引物对病毒及类病毒基因组的特异性片段进行PCR扩增，通过观察特异性条带而对这些病原进行鉴定。①电泳分析②PCR技术第三节茎尖培养脱毒（2）核酸杂交技术其基本原理是两条互补核酸链的碱基可以相互配对而形成双链。两种不同来源的核酸链通过碱基配对形成双链的过程称为核酸杂交（nucleotidehybridization）。第三节茎尖培养脱毒采用特定的方法对一已知核酸片段进行标记，就可利用已知的核酸片段检测待检样品中是否有与该片段互补的核酸，这种带有特定标记的核酸片段称为核酸探针（probe）。核酸杂交技术在病毒尤其是基因组较小的类病毒，如马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）、柑橘裂皮类病毒（CEVd）等检测中有广泛的应用，采用该项技术的前提条件是制备相应核酸探针。第三节茎尖培养脱毒(六)脱毒植株的繁殖主要通过丛生芽途经：茎尖苗无病毒苗丛生芽完整植株生长鉴定生根培养检测培养第四节脱毒实例(一)柑橘的脱