+++++SDS-总结

SDS-PAGE总结SDS-PAGE——Sodiumdodecylsulphate---polyacrylamidegelelectrophoresis该方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统。一、聚丙烯酰胺凝胶(PAG)基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺（ammoniumpersulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状，具有三维网状结构，能起分子筛作用。用它作电泳支持物，对样品的分离取决于各组分所带电荷的多少及分子大小。含40％acrylamide-bisacrylamide的水溶液，其中acrylamide和bisacrylamide的比例为39:1。丙烯酰胺：吸烟、淀粉类食品高温（120℃）烹调，可产生丙烯酰胺。进入人体内的丙烯酰胺约90％被代谢，仅少量以原形经尿液排出。丙烯酰胺进入体内后，会在体内与DNA上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致遗传物质损伤和基因突变。丙烯酰胺具有神经毒性作用。丙烯酰胺属中等毒类，在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分罕见。N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）：双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺，N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇。在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团,可作为交联剂,能将线性高分子迅速转变为体型高分子,制备吸水性聚合物,还可与各种离子型单体发生聚合反应,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)：TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine，中文名为N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2，分子量为116.20。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。易燃，有腐蚀性。过硫酸铵（APS）：分子式(NH4)2S2O8分子量:228.20。是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。过硫酸铵属于非易燃品，但能释放氧而有助燃作用。必须存放在干燥、密闭的容器中，应避免阳光直射、热源、潮湿等不利因素。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。过硫酸铵（APS）——四甲基二乙胺(TEMED)系统：在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后，过硫酸铵[（NH4）2S2O8]产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在pH8.8条件下7％的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕；在pH4.3时聚合很慢，要90分钟才能完成。温度与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混合后的凝胶溶液放在近0℃的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低、氧分子或不纯物质存在，都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混合。二、SDS-PAGE电泳原理十二烷基硫酸钠（SDS）：Sodiumdodecylsulphate，即SDS。SDS是一种阴离子去污剂，又是阴离子型表面活性剂。在电泳体系中加入一定浓度的SDS，SDS以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。甘氨酸：最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH6.8),上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3),分离胶中含Tris-HCl(pH8.8)。系统中所有组分都含有0.1%的SDS(Laemmli,1970)。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。浓缩胶的浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液pH6.7，分离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。在上下电泳槽内充以Tris—甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓缩胶中HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl-＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而H2NCH2COO-称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成—个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成—条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。分离胶的电荷效应和分子筛效应：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。但在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位，这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。SDS-PAGE上样缓冲液（loadingbuffer）：蛋白上样缓冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。注意事项——分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分；含巯基的试剂有一定的毒性。使用说明——1.按每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)；2.100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白；3.冷却到室温后离心数秒钟，混均后再离30秒钟，取上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可；4.通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5-1cm)即可停止电泳。甘油或蔗糖——增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。溴酚蓝——指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。三、固定、染色和脱色甲醇/冰醋酸固定液：单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。甲醇——有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。冰醋酸——纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用0.3-0.5的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）：考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质——染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝，存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。考马斯亮蓝（CoomassiebrilliantblueG-250）——测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。四、结果分析1．绘制标准曲线将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图18-6所示。按下式计算相对迁移率mR：以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。2．根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。3．分析各蛋白质相对迁移率高氏主要是由什么决定的？相对迁移率=蛋白样品距离加样端迁移距离（cm）/溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm）以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量。标难曲线