01-2014级硕士高级免疫学实验技术-概述.

高级免疫学实验技术2014级硕士研究生吉林大学基础医学院免疫学系免疫学实验技术概述免疫学实验技术概述小调查-对免疫学实验技术的了解•目前你知道的免疫学实验技术有哪些？•这些免疫学实验技术的原理是什么？•这些技术有什么应用？免疫学实验技术概述现代免疫学技术免疫学技术的范畴1、对具有免疫活性物质的定性、定量测定2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定免疫学检测技术的评价一、评价标准Specificity（特异）Sensitivity（敏感）Simplicity（简便）Safety（安全）Saving（节约）二、特异性与敏感性的关系特异性高、敏感性低敏感性高、特异性低免疫学实验技术概述•抗原抗体反应•淋巴细胞的检测技术•细胞因子的检测技术•免疫学常用的分子生物学技术多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体前两者常用于实验研究，而后者用于临床治疗研究。抗体的应用多克隆抗体是通过免疫动物血清分离获得优点：制备方法比较简单，价格低廉，制备所需时间短等在确定新基因编码蛋白研究方面，仍然是首选抗体类型。但由于多克隆抗体含有针对多个抗原表位的抗体成分，也可能包括抗原变性后暴露的新抗原表位，因此，多克隆抗体在检测变性抗原——如采用WesternBlot检测蛋白时，其效果比单克隆抗体更敏感。多克隆抗体缺点：•纯度差•易发生交叉反应•来源有限•所产生的抗体因动物个体差异滴度不同•不易标准化因免疫动物血清中含有非常复杂的多种蛋白质成分，所以在进行实验室分析、检测之前，必须将其有效的抗体成分分离、纯化。多克隆抗体单克隆抗体(mAb)是通过B细胞杂交瘤获得与多克隆抗体相比，单克隆抗体主要具有以下三个显著特点（优点）：•①高度均质性•②高度特异性•③来源稳定不足：制备方法比较复杂，价格昂贵，制备所需时间较长。单克隆抗体根据实验的目的不同，其分离、纯化的纯度要求也不同。作为ELISA检测时的抗体，部分情况下饱和硫酸胺纯化即可；最常使用的抗体是经过A蛋白(ProteinA)亲和层析获得的IgG型抗体；免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级纯才可应用(亲和层析纯+SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯)。纯度要求单克隆抗体在制备过程中经过严格的筛选，因此应根据不同的应用目的选择不同单克隆抗体亚类，如标明供ELISA检测用的单克隆抗体，可能不适合WesternBlot检测。作为初学者尤其应该注意各类单克隆抗体标明的应用范围，而多克隆抗体一般情况下均有较宽的适用范围。适用范围一抗和二抗•一级抗体：抗原特异性的抗体•二级抗体：抗抗体（针对一抗的Fc段，具有种属特异性）AgAg•沉淀反应•凝集反应•免疫标记技术抗原抗体反应的特点1.抗原与抗体的结合是特异性的﹡交叉反应2.抗原抗体结合是可逆的引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体特异性结合阶段可见反应阶段4.抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关抗体过剩区抗原过剩区等价区1.抗原与抗体的结合是特异性的﹡交叉反应2.抗原抗体结合是可逆的引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体特异性结合阶段可见反应阶段4.抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关抗体过剩区抗原过剩区等价区1.抗原与抗体的结合是特异性的﹡交叉反应2.抗原抗体结合是可逆的引力：氢键、疏水键、静电引力、范德华力斥力：电子云产生的排斥力3.抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体特异性结合阶段可见反应阶段4.抗原抗体的分子比例与抗原抗体结合是否呈现可见的反应现象密切相关抗体过剩区抗原过剩区等价区沉淀反应（Precipitation)血清、蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下结合出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。凝集反应(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应抗体（或抗原），在电解质存在的条件下形成凝集物的现象，称为凝集反应。。免疫标记技术用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定性、定量或定位检测。抗原抗体反应淋巴细胞的检测技术•淋巴细胞的分离•淋巴细胞的功能测定技术淋巴细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离淋巴细胞分离液密度梯度离心法二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定1.E花环分离法2.尼龙纤维分离法3.免疫荧光法4.流式细胞术5.磁珠分离术淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离液（聚蔗糖与泛影葡胺）比重为1.077左右红细胞和多核系白细胞比重1.092单个核细胞比重为1.0704．将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000r/min离心30min，离心后，管内分层如下图所示4．将离心管置水平式离心机内，在18～20℃下，以2000r/min离心30min，离心后，管内分层如下图所示EE花环分离法花环分离法（纯化（纯化TT细胞）细胞）TT细胞表面的细胞表面的CD2CD2分子－绵羊红细胞受体（分子－绵羊红细胞受体（EE受体）受体）免疫磁珠分离术1.1.直接法：直接法：抗细胞表面分子抗体抗细胞表面分子抗体++磁性微球磁性微球免疫磁珠免疫磁珠++细胞悬液细胞悬液强磁场强磁场与免疫磁珠结合的细胞与免疫磁珠结合的细胞2.2.间接法：间接法：第二抗体第二抗体++磁性微粒磁性微粒第一抗体第一抗体++细胞细胞磁场磁场特定细胞特定细胞流式细胞术（FlowCytometry，FCM）FCMFCM将免疫荧光技术应用于流式细将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。测，并将不同类型的细胞分选收集。FCMFCM还可对同一细胞的多种参数（如还可对同一细胞的多种参数（如DNADNA、、RNARNA、、蛋白质和细胞体积等）进蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，是当代生命科学研究领行多信息分析，是当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。域中广泛使用的一项新技术。免疫荧光法（区分不同的淋巴细胞群或亚群）抗抗CD3CD3mAbmAb，抗，抗CD4CD4mAbmAb，抗，抗CD8CD8mAbmAb++外周血淋巴细胞外周血淋巴细胞荧光标记的第二抗体荧光标记的第二抗体荧光显微镜下计数荧光染色阳性细胞百分数荧光显微镜下计数荧光染色阳性细胞百分数尼龙纤维分离法BB细胞和单核细细胞和单核细胞具有易粘附特胞具有易粘附特性，将淋巴细胞悬性，将淋巴细胞悬液加到尼龙纤维液加到尼龙纤维上，上，3737℃℃作用作用11－－22小时后，洗脱的为小时后，洗脱的为非粘附性非粘附性TT细胞。细胞。T细胞尼龙纤维毛柱PBMCB细胞单核细胞淋巴细胞的功能测定技术一、体外法1.淋巴细胞增殖试验2.细胞毒试验3.酶联免疫斑点法二、体内法淋巴细胞增殖试验一、T细胞增殖试验1.形态学检查2.3H-TdR掺入法3.MTT法二、B细胞增殖试验T细胞增殖试验（形态学示意图）原理：T细胞体外受特异性抗原物质（如细菌类毒素）、非特异性有丝分裂原（如PHA、ConA）的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴母细胞，以此测定T细胞的功能。正常人转化率为70％左右。PHA刺激48~72小时T细胞增殖试验（（33HH--TdRTdR掺入法）掺入法）原理原理：：淋巴细胞被有丝分裂原ConA或PHA激活后，进入细胞周期进行有丝分裂，当细胞进入S期，细胞合成DNA明显增加，在培养液中加入3H标记的DNA合成原料脱氧胸腺嘧啶核苷(TdR)，则3H-TdR作为合成DNA的原料被摄入细胞，掺入新合成的DNA中，根据同位素掺入细胞的量则可推测淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位素经β-液体闪烁仪检测。四甲基偶氮唑盐法（MTT）淋巴细胞被有丝分裂原等激活发生转化，在细胞培养终止前数小时加入MTT，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶分解MTT产生蓝色甲臜（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臜的量与细胞增殖程度成正相关。B细胞增殖试验不溶性SPA是人B细胞的高效促分裂原，对T细胞无刺激作用。在淋巴细胞悬液中加入不溶性SPA，混匀培养3天，培养结束前22小时加入3H-TdR，采用3H-TdR掺入法检测B细胞的增殖程度。淋巴细胞增殖试验淋巴细胞在有丝分裂原或特异性抗原的作用下，细胞内核酸和蛋白质合成增加，同时细胞形态转化为原始母细胞。此实验可测定淋巴细胞的应答功能，称淋巴细胞转化试验(lymphocytetransformationtest).细胞毒试验抗体依赖细胞介导的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验NK细胞的细胞毒试验抗体依赖细胞介导的细胞毒试验(Antibody-dependentCell-mediatedCytotoxity,ADCC)原理：选用适当的靶细胞（鸡、鸭、羊红细胞），加相应的免疫血清，再加入待检测的效应细胞，作用一段时间后，观察靶细胞破坏的程度并以此推测效应细胞的ADCC作用。应用：检测NK细胞、MΦ及中性粒细胞的细胞毒作用。补体依赖的细胞毒试验（ComplementDependentCytotoxity，CDC）原理：抗体与细胞表面的抗原结合后可激活补体活化的经典途径，使细胞膜损伤甚至溶解，细胞被杀死后容易被着色，根据死细胞多少可以判断细胞毒活性的强弱。应用：器官移植时HLA定型。细胞介导的细胞毒试验（CellMediatedCytotoxity）CTL对靶细胞有直接杀伤作用，能直接杀伤某些肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CTL的细胞毒活性是评价机体细胞免疫功能的指标。NK细胞的细胞毒试验选用K562细胞作为靶细胞，与NK细胞混合培养后，以形态学或同位素法检测NK细胞对K562细胞的杀伤活性。酶联免疫斑点法（Enzyme-LinkedImmunospot,ELISPOT）在ELISA的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。体内法检测淋巴细胞功能原理：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。常用抗原：结核菌素（OT）链激酶－链道酶（SK－SD）结果判定：注射48-72h后观察，注射局部出现红肿、硬结，直径大于0.5cm为阳性。应用：检测免疫缺陷病、观察肿瘤患者免疫功能、疗效和预后。细胞因子的检测技术细胞因子的检测技术机体的免疫细胞(如淋巴细胞、单核巨噬细胞)及非免疫细胞能产生不同种类的细胞因子，它们在免疫应答中起调控作用。细胞因子检测是判断机体免疫功能的重要指标，对某些疾病的诊断、病程观察、预后判断等是十分必要的。生物活性检测依赖细胞株增殖法：某些肿瘤的细胞株必须依赖于某种细胞因子才能在体外增殖，并且增殖程度与细胞因子含量成正比。细胞增殖程度可用3H-TdR和MTT法检测。特点：敏感性高，但并非每个细胞因子都有相应的依赖株。靶细胞杀伤法：TNF对L929细胞有杀伤作用，可用染色法检测。细胞病变抑制法：IFN抑制病毒所致的靶细胞病变。细胞因子诱导产物分析法：IL-1刺激T细胞产生IL-2等。免疫学检测因为细胞因子具有抗原性，所因为细胞因子具有抗原性，所以可以应用抗原以可以应用抗原--抗体反应进行定抗体反应进行定量检测。量检测。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA））放射免疫测定法放射免疫测定法(RIA)(RIA)酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)(ELISPOT)免疫印迹法免疫印迹法(Westernblot)(Westernblot)放射免疫测定法(RIA)示意图Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知待测抗原含量测定A