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题目薄层色谱法操作规程页次共2页第1页编订依据《中国药典》2010版一部编码PZ-C-038-00分发部门品质部版次第一版（2015）制定人审核人批准人制定日期审核日期批准日期1.目的：建立薄层色谱法操作规程，保证规范操作。2.范围：适用于产品原料的鉴别。3.职责：品质部质检员对本标准的实施负责。4程序：4.1原理薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。4.2仪器与材料4.2.1薄层板①市售薄层板：市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜等。②自制薄层板：在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254、微晶纤维素等，其颗粒大小，一般要求粒径为10～40μm，加水或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2％～0.5％）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。使用涂布器徐布应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。玻板应光滑、平整，洗净后不附水珠。4.2.2点样器：一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。4.2.3展开容器：上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开缸。4.2.4显色装置：喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸溃显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。4.2.5检视装置：为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用，暗箱内光源应有足够的光照度。4.2.6薄层色谱扫描仪系指用一定波长的光对薄层板上有吸收的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点，进行扫描，将扫描得到的谱图和积分数据用于物质定性或定量的分析仪器。4.3操作方法4.3.1薄层板制备①市售薄层板：临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，110℃活化，置干燥器中备用。②自制薄层板：除另有规定外，将1份固定相和3份水（或加有黏合剂的水溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。4.3.2点样：除另有规定外，在沽净干燥的环境，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上，一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10～15mm，高效板一般基线离底边8～10mm。圆点状直径一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带状宽度一般为5～10mm。高效板条带宽度一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。4.3.3展开：将点好供试品的薄层板放入展开缸中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，一般保持15～30分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放入载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内侧放置与展开缸内径同样大小的滤纸，密闭一定时间，使达到饱和再如法展开。必要时，可进行二次展开或双向展开。4.3.4显色与检视：供试品含有可见光下有颜色的成分可直接在日光下检视，也可用喷雾法或浸渍法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在日光下检视。有荧光的物质或遇某些试剂可激发荧光的物质可在365nm紫外光灯下观察荧光色谱。对于可见光下无色，但在紫外光下有吸收的成分可用带有荧光剂的硅胶板（如硅胶GF254板），在254nm紫外光灯下观察荧光板面上的荧光猝灭物质形成的色谱。4.3.5记录：薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层扫描仪扫描记录相应的色谱图。4.4系统适用性试验按各品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照品对实验条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度和重复性要求。①检测灵敏度：用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点．②分离度：用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰分离的斑点。用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：R＝2（d2－d1）／（W1＋W2）式中d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.0。③重复性：同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0％；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0％。4.5测定法4.5.1鉴别：取适宜浓度的对照溶液与供试品溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的颜色（或荧光）和位置应与对照溶液的斑点一致。4.5.2限度检查：采用定量配制的对照品对照或对照品稀释对照。供试品溶液色谱中待检查的斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的相应斑点比较，颜色（或荧光）不得更深；或照薄层色谱扫描法操作，峰面积值不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定检查的斑点数和限量值。4.5.3含量测定：照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。4.6注意事项4.6.1自制薄层色谱板时所用玻璃板应洗净不挂水珠，光滑平整，铺板要均匀，厚度适宜，并于室温下晾干后在110℃活化30分钟，置于有干燥剂的干燥箱或干燥器中备用。4.6.2点样时，点样点一般为圆点，切记不能太大。点样斑点离板边距离应大于10mm，否则会因边缘溶剂的挥发，使斑点随之偏离而产生边缘效应。4.6.3应在层析缸口涂适量凡士林，增加密封性。4.6.4吸附剂的活性和含水量有密切关系，含水较多，吸附能力就大为减弱，因此临用前必须把薄层板在110℃活化30分钟，以驱除水分，增强吸附能力，改善薄层板的分离效果。